Neste trabalho propõe-se a construção de linhagens de leveduras S. cerevisiae com aumento na tolerância a altas concentrações de glicose e rendimento de produção de etanol. Para que este objetivo fosse atingido, numa primeira etapa, foi realizada uma mutagênese sítio dirigida do gene SPT15 para introduzir três mutações (spt15-300), utilizando a técnica de SOEing PCR. Para tanto o DNA genômico da linhagem S. cerevisiae S288C foi extraído e utilizado como molde para amplificação por SOEing PCR, para obtenção do alelo spt15-300. O produto de PCR (spt15-300) foi empregado na mistura de ligação com o vetor pGEM-T (Promega) e após 16 horas de incubação a 4°C, a mistura de ligação foi empregada na transformação genética da linhagem E. coli DH5α, pelo método de eletroporação. A seleção dos transformantes foi realizada em meio LB ágar contendo ampicilina (100 mg/ml) e suplementado com X-GAL e IPTG. Os clones recombinantes foram diferenciados por sua coloração branca. O DNA plasmidial foi isolado ("mini-prep"), purificado e digerido com a enzima de restrição BamHI, para liberar o inserto spt15-300. A confirmação da clonagem foi realizada através da reação de PCR empregando como molde o DNA isolado dos plasmídios recombinantes obtidos, empregando-se os "primers" utilizados no início da amplificação de spt15-300. Conforme esperado, este procedimento resultou na amplificação de um produto de DNA com, aproximadamente, 750pb correspondente ao spt15-300. Este alelo mutado será utilizado numa próxima etapa para clonagem no vetor pGEMT- Easyδ, desenvolvido previamente em nosso laboratório.