| Área: Fermentação e Biotecnologia ( Divisão J ) CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA ALFA-AMILASE EM LINHAGEM LABORATORIAL DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATRAVÉS DO SISTEMA "DELTA-INTEGRAÇÃO" Fábio Silva de Carvalho (USP); Keina Poliana Pivarro Dalmolin (USP); Ana Raquel de Souza Monteiro (USP); Elisabete José Vicente (USP)
ResumoO Brasil é reconhecido mundialmente pela produção do etanol combustível, sendo seu principal substrato a cana-de-açúcar. Estudos recentes apontam a mandioca como uma das melhores fontes renováveis para a produção de etanol, por consumir menos energia no processo agroindustrial e possuir um sistema de cultivo mais sustentável, quando comparada à cana ou ao milho (Salla, 2008). Saccharomyces cerevisiae é reconhecidamente o organismo mais utilizado no processo industrial de fermentação, porém esta levedura não possui a capacidade de hidrolisar moléculas de amido. Visando a obtenção de clones recombinantes com esta capacidade, genes codificadores de enzimas amilolíticas vêm sendo clonados nesta levedura.
O ojetivo deste trabalho foi clonar e expressar o cassete de expressão do gene da a-amilase de B. subtilis em S. cerevisiae, empregando o sistema delta-integração (Gerra et al., 2005).
O cassete de expressão da a-amilase com o promotor constitutivo do gene da álcool-desidrogenase ADH1 foi isolado do plasmídeo pAA3 (Moraes, 1995), empregando-se a endonuclease BamHI e, em seguida, inserido no vetor pGEMT-Easyd, responsável pelo sistema delta-integração. Esta estratégia permitiu a inserção de múltiplas cópias do cassete de expressão no genoma da levedura, que foram integradas por homologia nos sítios do elemento (d) do transposon Ty1. Para a confirmação da integração, os transformantes foram semeados em meio sólido YPDA (0,5% de amido) e foi observada a formação de halos de amilolise quando as colônias foram submetidas ao vapor de iodo.
Foram isolados inúmeros clones recombinantes, desses 104 foram analisados quanto à degradação do amido no meio, sendo encontrado um clone que expressa o gene da a-amilase. Assim esta é mais uma grande ferramenta que poderá ser empregada para a otimização do processo de produção do etanol a partir de substratos amiláceos.
Palavras-chave: etanol, fermentação de amido, delta-integração, Saccharomyces cerevisiae |