TIPAGEM MOLECULAR DE YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS POR ERIC-PCR E MLST

Priscilla Fernanda Martins Imori (FCFRP/USP); André Pitondo da Silva (FCFRP/USP); Roberto Antonio de Souza (FCFRP/USP); Juliana Pfrimer Falcão (FCFRP/USP)

Y. pseudotuberculosis é uma das mais importantes espécies patogênicas do gênero Yersinia, sendo a adenite mesentérica aguda a forma mais freqüente de manifestação clínica. A mortalidade por septicemia pode chegar a 75%, mesmo com o uso de antimicrobianos. As metodologias de Multilocus Sequence Typing (MLST) e Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC-PCR) vêm sendo utilizadas com sucesso para estudos taxonômicos e filogenéticos de bactérias pertencentes ao gênero Yersinia. O objetivo deste trabalho foi comparar as técnicas de MLST e ERIC-PCR quanto ao poder dessas em discriminar genotipicamente 34 linhagens de Y. pseudotuberculosis isoladas de animais no sul do Brasil, entre os anos de 1982 e 1990. Para o MLST, foram amplificados sete genes housekeeping (adk, argA, aroA, glnA, thrA, tmk e trpE). Após as amplificações, cada produto de PCR foi seqüenciado pelo menos duas vezes em ambas as direções. Para cada uma das linhagens estudadas foram obtidas seqüências consenso utilizando o programa ChromasPro 1.41. Para o ERIC-PCR, as amplificações foram feitas com 100ng de DNA molde, cada dNTP a 0,4mM, 4mM MgCl₂, 1U Klen Taq DNA polimerase, 1X tampão para PCR e 20pmol de cada primer universal de ERIC-PCR (5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3' e 5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3'). O programa usado foi: desnaturação inicial de 7 min a 94ºC, 30 ciclos constituídos de 30 s a 94ºC, 1 min a 52ºC e 8 min a 65ºC, e extensão final de 10 min a 65ºC. Somente bandas entre 100 e 5000 pb foram incluídas na análise de ERIC-PCR. A construção dos dendrogramas de similaridade genotípica para ERIC-PCR e MLST foram realizadas pelo programa BioNumerics 5.1 utilizando-se o algorítimo UPGMA. No MLST, usou-se o modelo de correção Kimura 2 parâmetros e no ERIC-PCR o cálculo de similaridade foi realizado utilizando-se o índice DICE. O cálculo do índice de discriminação (ID) foi baseado numa variação do Índice de Diversidade de Simpson. O MLST separou as 34 linhagens em dois MLST-tipos, enquanto o ERIC-PCR, em 29 ERIC-tipos. O ID do ERIC-PCR foi 0,9875 e o do MLST foi de 0,0588. Conclui-se que o ERIC-PCR teve um poder discriminatório superior ao do MLST, sendo mais indicado para a subtipagem de linhagens das Y. pseudotuberculosis estudadas.