| Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N ) EXPRESSÃO DA E-NTPDASE DE LEISHMANIA MAJOR "GDPASE" EM KLUYVEROMICES LACTIS
Yaro Luciolo dos Santos (UFV); Carolina Maria de Araújo dos Santos (UFV); Márcia Rogéria Almeida (UFV); Juliana Lopes Rangel Fietto (UFV); Flávia Maria Lopes Passos (UFV)
Resumo
A levedura Kluyveromices lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. Para obter um sistema de expressão e secreção heteróloga desta proteína em K. lactis, a técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma sequência de 2073 pb referente à região codificante completa da "GDPase" de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5mM de acetamida e induzidos em batelada em YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Fazendo uma pesquisa no Genbank encontramos dois genes homólogos no genoma da levedura: KIGDA1 e KIYND1 que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados apontam para não obtenção dos transformantes produtores da GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor Plac4 que dirigia a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor Plac4. (CAPES)
Palavras-chave: Apirases, GDPase, Kluyveromyces lactis, Leishmania major, pKLAC1 |