| Área: Microbiologia Geral e Meio Ambiente ( Divisão L ) CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UMA ß-GLICOSIDASE ESTIMULADA POR GLICOSE E XILOSE PURIFICADA DO FUNGO TERMÓFILO HUMICOLA INSOLENS   Flavio Henrique Moreira Souza (FFCLRP-USP); Sandra Abrão Lazari (FFCLRP-USP); Douglas Chodi Masui (FFCLRP-USP); Francisco de Assis Leone (FFCLRP-USP); João Atílio Jorge (FFCLRP-USP); Rosa dos Prazeres Melo Furriel (FFCLRP-USP)
ResumoMateriais lignocelulósicos são os principais resíduos da atividade agroindustrial e existe grande interesse na sua degradação enzimática, visando à produção de compostos químicos com baixo impacto ambiental, particularmente etanol. A hidrólise enzimática da celulose envolve três classes de enzimas: endoglucanases, exoglucanases e ß-glucosidases. Endo- e exoglucanases agem diretamente sobre a celulose, despolimerizando as cadeias e liberando celooligossacarídeos e celobiose, que são hidrolisados a glicose por ação das ß-glucosidases. Este conjunto de enzimas atua sinergicamente e as ß-glucosidases catalisam o passo limitante da velocidade de sacarificação da celulose, liberando endo- e exoglucanases da inibição por celobiose e celooligossacarídeos curtos. Entretanto, a maioria das ß-glucosidases é inibida pelo produto, gerando interesse crescente por enzimas tolerantes à glicose.
Uma ß-glucosidase do fungo termófilo Humicola insolens foi purificada e caracterizada bioquimicamente. O fungo foi cultivado em meio líquido suplementado com avicel 0,75% por 96 h a 40°C e 140 rpm. A enzima foi purificada por cromatografia em DEAE-Fractogel e Sephadex G-200. A atividade enzimática sobre substratos sintéticos foi determinada a 50°C em tampão Bis-Tris, pH 6,0, acompanhando a liberação de p-nitrofenolato (e410nm, pH 12= 17,500 M-1.cm-1). A hidrólise de substratos naturais foi estimada nas mesmas condições quantificando a glicose total liberada pelo método da glicose oxidase, ou os açúcares redutores totais pelo método do ácido dinitrosalicilico (DNS). Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 mmol de produto por minuto.
A enzima purificada apresentou 21% de carboidratos e massa molecular aparente de 94 kD, estimada por filtra ção em gel. A análise em SDS-PAGE mostrou uma única banda protéica de 55 kDa, sugerindo que a enzima nativa é um homodímero. Análise por espectrometria de massas revelou similaridade de seqüência de aminoácidos com uma ß-glucosidase de Humicola grisea var. thermoidea, com 22% de cobertura. Temperatura e pH ótimo corresponderam a 60ºC e 6,0 - 6,5, respectivamente. A enzima mostrou-se estável por 1h a 50ºC, com tempo de meia vida de 40 min a 55ºC. A ß-glucosidase purificada hidrolisou celobiose, lactose, p-nitrofenil-ß-D-glicopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-xilanopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-galactopiranosideo, o-nitrofenil-ß-D-galactopiranosideo e salicina. Estudos cinéticos mostraram que os melhores substratos foram p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosideo e celobiose. A atividade enzimática foi estimulada por glucose ou xilose até 400 mM, com efeito estimulatório máximo (2 vezes) em 40 mM. Alta eficiência catalítica para o substrato natural, boa estabilidade térmica, forte estimulação por glicose ou xilose e tolerância a elevadas concentrações destes monossacarídeos qualificam esta enzima para aplicação na hidrólise de materiais celulósicos.
Palavras-chave: ß-glicosidase, ß-glucosidase, ß-glucosidase estimulada por glicose, Humicola insolens, Sacarificação da celulose |