ERIC-PCR E PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS PARA ESTUDOS DE TAXONOMIA E IDENTIFICAÇÃO DE LINHAGENS BIOQUIMICAMENTE ATÍPICAS DE YERSINIA SPP.

Roberto Antonio de Souza (FCFRP/USP); Juliana Pfrimer Falcão (FCFRP/USP)

A classificação das diferentes espécies de Yersinia é baseada, sobretudo em características bioquímicas. O Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras que Y. pestis recebeu mais de 700 amostras que foram confirmadas como Yersinia. Entretanto, sete linhagens não puderam ser identificadas bioquimicamente em nenhuma das espécies de Yersinia atualmente conhecidas e, por isso, foram denominadas de atípicas. O objetivo desse trabalho foi identificar essas linhagens atípicas através de ERIC-PCR e Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE). Foram estudadas 52 linhagens representativas das diferentes espécies de Yersinia e sete linhagens bioquimicamente atípicas. Na técnica de ERIC-PCR, as amplificações foram feitas com 100ng de DNA molde, cada dNTP a 0,4 mM, 4 mM MgCl₂, 1U Taq DNA polimerase, 1X tampão para PCR e 20 pmol de cada primer (5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3' e 5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3'). O programa usado foi: desnaturação inicial de 7 min a 94ºC, 30 ciclos constituídos de 30 s a 94ºC, 1 min a 52ºC e 8 min a 65ºC, e extensão final de 10 min a 65ºC. Para a técnica de PFGE, o DNA de cada linhagem preparado em plugs de agarose PFGE foi digerido com 40 unidades de Xba I e submetido às seguintes condições no aparelho CHEF-DR III: pulso inicial de 1 s, pulso final de 10 s, 6v/cm, ângulo de 120º por 29 horas. A análise dos dados foi feita através do programa BioNumerics 5.1. Somente bandas entre 300 e 5000 pb foram incluídas na análise de ERIC-PCR e somente bandas entre 48,5 e 242,5 Kb foram incluídas na análise de PFGE. A construção dos dendrogramas de similaridade genotípica foi realizada pelo programa BioNumerics 5.1, utilizando-se o algoritmo Neighbor-joining e o cálculo de similaridade utilizando o índice DICE. Na técnica de ERIC-PCR houve a formação de clusters espécie-específicos para a maioria das espécies de Yersinia. Além disso, quatro linhagens atípicas foram agrupadas junto a uma linhagem de Y. frederiksenii, uma junto a representantes de Y. mollaretii e Y. enterocolitica e duas junto à linhagem representante de Y. ruckeri. Na técnica de PFGE, não houve a formação de clusters espécie-específicos para nenhuma das espécies de Yersinia e as linhagens atípicas foram distribuídas aleatoriamente pelo dendrograma. Conclui-se que ERIC-PCR foi melhor que PFGE para identificar em espécies linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia.