PCR-MULTIPLEX ALELO ESPECÍFICO (PCR-MAS) PARA A DETERMINAÇÃO RÁPIDA DA SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS ISONIAZIDA E RIFAMPICINA EM MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ISOLADOS NO AMAZONAS

Mauricio Morishi Ogusku (INPA); Lucas Hidenori Okamura (UNIP); Eveleise Samira de Jesus Martins (INPA); Aya Sadahiro (UFAM); Julia Ignez Salem (INPA)

O aumento de casos de Tuberculose (TB) resistentes às drogas anti-TB representa uma ameaça ao sucesso dos Programas de Controles. Isto faz com que os pacientes permaneçam infectados por meses ou anos e ao mesmo tempo transmitindo bacilos resistentes ou multiresistentes. Dessa forma, é imprescindível a detecção rápida da sensibilidade em isolados de Mycobacterium tuberculosis para personalizar o tratamento, controlar o desenvolvimento e a propagação de bacilos resistentes, bem como reduzir o custo do tratamento. A maioria das cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina (RIF) apresentam mutações em uma região do gene rpoB. Alguns códons estão mais frequentemente associados com as mutações: 531, 526 e 516. Para isoniazida (INH) as mutações associadas à resistência foram relatadas em pelo menos quatro loci genéticos diferentes: katG, inhA, ahpC e oxyR. Porém, o códon katG315, está mais frequentemente associado com a resistência à INH. Assim, o método de PCR-MAS foi desenvolvido para detectar simultaneamente as sequencias não mutadas mais comumente observadas em isolados de M. tuberculosis sensíveis à INH (katG e inhA) e à RIF (rpoB). Diante do exposto, a avaliação da sensibilidade às drogas INH e RIF em M. tuberculosis isolados em Manaus – AM pelo método de PCR-MAS constituiu o objetivo principal deste estudo. A PCR-MAS teve como alvos o códon 315 do gene katG, os códons 516, 526 e 531 do gene rpoB e a posição -15 da região promotora do gene mabA-inhA, na qual foram utilizados oito primers alelos-específicos divididos em duas PCR multiplex. No desenho dos primers, o final 3’ de cada primer alelo-específico foi posicionado para parear com o nucleotídeo do respectivo códon da seqüência da cepa H37Rv (sensível para todas as drogas). As mesmas posições onde os pontos de mutações mais freqüentes foram relatados para as cepas resistentes. Desta maneira quando não houve mutação existente no códon, o fragmento foi amplificado. Trinta e cinco isolados de M. tuberculosis foram submetidos ao método padrão das proporções e à PCR-MAS. Vinte e oito cepas foram isoladas no Laboratório de Micobacteriologia do INPA e foram sensíveis à INH e RIF pelo método das proporções. Os sete isolados restantes foram cedidos pelo Instituto Adolfo Lutz - SP. Destes, 5 foram resistentes a INH e RIF, 1 resistente a INH e 1 resistente a RIF pelo método das proporções. Pela PCR-MAS, os 28 isolados de M. tuberculosis sensíveis pelo método das proporções também o foram pela PCR-MAS, resultando em 100% de co-positividade entre os métodos. Dos 5 isolados de M. tuberculosis resistentes à INH e RIF, 4 apresentaram mutações associadas aos genes katG e rpoB (co-positividade 80%). Um isolado resistente à RIF apresentou mutação no gene rpoB; e um isolado resistente à INH não apresentou mutação associada. Estes resultados sugerem que a PCR-MAS pode contribuir para se estabelecer a antibioticoterapia específica para TB enquanto os ensaios bacteriológicos de sensibilidade são realizados.