CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS: ESTUDO DA VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL QUE CONTROLA O CRESCIMENTO A 37^OC PELA TÉCNICA DE MUTAÇÃO INSERCIONAL ASSISTIDA POR AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS

Thiago C. Bertolin Bertolin (UNIFESP); Renata C. Pascon Pascon (UNIFESP); Larissa Fernandes Matos (UnB); Marcelo A. Vallim Vallim (UNIFESP)

O basidiomecto Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico oportunista do homem, possui dois tipos sexuais (α e a), é haplóide, encapsulado, se reproduz por brotamento, além de produzir melanina. Este fungo possui três variades, var neoformans, var grubii e var gattii, sendo esta última elevada a categoria de espécie (C. gattii). Ainda ele possui 5 sorotipos (A, B, C, D e AD) com distribuição geográfica distinta onde os sorotipos B e C (var gattii) são encontrados em regiões tropicais e subtropicais, ja o sorotipo D tem distribuição mundial enquanto os sorotipos A (var grubii) e AD são encontrados em regiões temperadas. O aumento da população imunocomprometida em função da pandemia da AIDS, desenvolvimento de quimioterápicos mais agressivos que contribuem para o tratamento contra o câncer em detrimento do sistema imunológico, e o aumento do número de transplantes realizados com uso extensivo de novos imunosupressosres, ampliaram o interesse por este fungo. Inúmeras características fenotípicas de C. neoformans são definidas como fatores de virulência: presença de cápsula, produção de melanina, e capacidade de crescer a 37ºC. A proposta deste trabalho é utilizar a técnica de mutação por inativação insercional mediada por Agrobacterium tumefaciens no fungo C. neoformans (linhagem selvagem KN99α, sorotipo A), visando ampliar o conhecimento da via de transdução de sinal controlada por RAS1 que possibilita o crescimento a altas temperaturas. Como marcadores empregamos os genes que conferem resistência aos antibióticos higromicina e neomicina, os quais foram inseridos aleatoriamente no genoma do fungo. Utilizando esta metodologia obtivemos 770 mutantes sensíveis aos antibióticos, dos quais 61 apresentaram-se sensíveis a temperatura de 37ºC. Com o auxílio da técnica de PCR invertido, seguido de sequenciamento, caracterizamos inicialmente 5 mutantes, sensíveis a temperatura de 37ºC, contendo inativações insercionais nos seguintes genes: aminopeptidase, dihydroorotase, ARF guanyl-exchange nucleotide factor, succinate-semialdehyde dehydrogenase e thymidylate synthase.