MÉTODO DE DETECÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA SÍNTESE DE POLÍMERO BIODEGRADÁVEL EM ESPÉCIES DO GÊNERO BURKHOLDERIA.

Yeimy Paola Galindo Rozo (USP); Erica Mendes Pereira (USP); Jose Gregório Cabrera Gomez (USP); Luiziana Ferreira da Silva (USP)

Polihidroxialcanoatos (PHA) são polímeros biodegradáveis produzidos e acumulados intracelularmente por muitos microrganismos. A enzima PHA sintase (PhaC) é a responsável pela polimerização de hidroxiacil-CoA, monômero precursor do polímero PHA. Baseadas em suas propriedades estruturais e especificidade de substrato estas enzimas são agrupadas nas classes I, II, III e IV. Espécies do gênero Burkholderia apresentam apenas a classe I de PhaC, capaz de polimerizar monômeros com cadeia carbônica curta (3 a 5 átomos de carbono). O operon envolvido na síntese de PHA apresenta diferentes organizações genéticas, mas, em Burkholderia é formado pelos genes phaC, phaA, phaB, que codificam, respectivamente a PHA sintase, a 3- cetotiolase, e a 3-acetoacil-CoA redutase. Neste trabalho, foram feitos alinhamentos de seqüências disponíveis em bancos de dados referentes aos nucleotídeos dos genes phaC de Burkholderia. Foram desenhados primers degenerados específicos para diferentes grupos de espécies desse gênero (3 diretos e 2 reversos). Utilizando técnicas de amplificação por PCR, as diferentes combinações destes primers foram testadas frente ao DNA genômico de 30 linhagens pertencentes ao gênero Burkholderia isoladas de diferentes ambientes. Os produtos de amplificação foram clonados no vetor pGEM-T Easy e seqüenciados. Os primers reversos desenhados, não permitiram evidenciar nenhuma diferença quando testados com o mesmo primer direto, provavelmente pela alta similaridade destes primers. 15 linhagens apresentaram amplicons com a combinação de primers específicos para B. cepacia e B. cenocepacia. As 15 linhagens restantes incluindo B. sacchari LFM101 apresentaram amplicon apenas quando testada com os primers FPE1/RPE1 os quais foram desenhados a partir das seqüências de B. xenovorans, B. phymatum e B. phytofirmans. Todas as linhagens foram testadas com o par de primers FPE3/RPE1 e não foi observado nenhum produto de amplificação por PCR. O resultado foi o esperado, pois o primer FPE3 foi construído a partir das seqüências de B. mallei e B. pseudomallei, conhecidas como patôgenos humanos e as linhagens usadas foram isoladas de amostras ambientais de cana de açúcar e solo contaminado com BTEX, presumindo a não existência destas espécies. Para verificar a seletividade dos primers diretos, todas as linhagens foram testadas com as três combinações possíveis. Todos os pares de primers foram efetivos para amplificar o gene phaC de Burkholderia spp. apresentando amplicons do tamanho esperado (Aprox. 2,2Kb) e permitindo separar e distinguir 3 grupos de Burkholderia.