Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, quer seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Métodos que empregam a PCR-tempo real (PCR-RT) vem ganhando aprovação para detecção de patógenos, inclusive os de origem alimentar. A transcriptase reversa-PCR (RT-PCR) tem sido empregada em conjunto com PCR-RT, permitindo a detecção e a quantificação de mRNA de uma única célula. O propósito do estudo foi desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT).

2. Material e Métodos

Caldos de carne suína e de ave foram preparados, coletados em tubos estéreis e foram denominados alimento-modelo suíno e alimento-modelo ave. Alíquotas desses alimentos-modelo foram artificialmente contaminadas com população elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) de Salmonella Typhimurium DT 104, mantidas a 20 °C e a 8 °C e submetidas à quantificação do patógeno em diferentes tempos pós-inoculação. Após estabilização celular, extração e purificação, o RNA total isolado foi quantificado por RT-PCR-RT utilizando como alvo o gene tuf num ensaio Salmonella-específico desenvolvido nesse estudo. Como controle empregou-se a enumeração de Salmonella por técnicas convencionais.

3. Resultados e Discussão

A quantificação de Salmonella por RT-PCR-RT apresentou limite de detecção de 2 log UFC_eq e eficiência de amplificação de 100%. Não houve diferença significativa entre os resultados obtidos pelo método convencional e o molecular (p≥0,05) tanto para população elevada como para baixa em ambos os alimentos-modelo mantidos a 20 °C e para os alimentos-modelo mantidos a 8^oC e com população baixa. Por outro lado, houve diferença significativa (p<0,05) para população elevada nas amostras mantidas a 8° C. Observou-se também que alimentos-modelo mantidos a 20 °C apresentaram uma queda mais rápida na expressão de tuf do que aqueles mantidos a 8 °C.

4. Conclusão

O método RT-PCR-RT empregando tuf apresenta potencial para uso, mas ainda precisa ser submetido a novas avaliações e aprimoramento, a fim de buscar melhoria no limite de detecção. Também é importante que seja avaliada a meia-vida do tuf-RNA, para que se possa quantificar somente RNA de células viáveis. A desvantagem deste método é a conversão de RNA para cDNA, que pode contribuir para as variações e a falta de reprodutibilidade devido ao estado dinâmico das células, a qualidade variável do RNA purificado e a disponibilidade do molde para a conversão.

5. Agradecimentos

CAPES, CNPq e DAAD.