EXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI, PURIFICAÇÃO, REENOVELAMENTO E PRODUÇÃO DE ANTISSORO POLICLONAL PARA A PORÇÃO C-TERMINAL RNA POLIMERASE RNA-DEPENDENTE DO SOUTHERN BEAN MOSAIC VIRUS

Tadaiti Ozato Junior (IBILCE - UNESP); Ricardo Barros Mariutti (IBILCE - UNESP); Jorge Alberto Marques Rezende (ESALQ-USP); Marinônio Lopes Cornélio (IBILCE-UNESP); José Osmar Gaspar (IBILCE - UNESP)

          O Southern bean mosaic virus (SBMV), espécie tipo do gênero Sobemovirus, é um fitovirus icosaéderico com partículas de aproximadamente 30nm de diâmetro e genoma de uma molécula de RNA de fita simples positiva de aproximadamente 4,0-4,5 kb. A organização genômica do SBMV compreende 3 cadeias abertas de leitura (Open Reading Frame–ORF) codificando para uma possível proteína do movimento célula-a-célula (ORF1), uma poliproteína com domínios de VPg, protease e RNA polimerase (ORF2a/2b) e a proteína capsidial (ORF3). O presente trabalho descreve a expressão, purificação e reenovelamento da porção C-terminal da RNA Polimerase RNA-dependente (RdRp) do SBMV, com a produção de antissoro específico em coelhos para a proteína recombinante. Os oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados a partir da sequência do SBMV depositada no GenBank e utilizados para amplificação em reações de PCR, utilizando-se como molde o DNA complementar (cDNA) sintetizado a partir do RNA viral. O fragmento amplificado foi clonado em vetor de expressão pET 28a e o vetor recombinante transformado em E .coli (BL21-DE3). A expressão foi induzida com 1mM de IPTG por 4 horas e a purificação da proteína recombinante foi feita através de cromatografia de afinidade por metal (Ni-NTA). O processo de purificação foi realizado sob condições desnaturantes e o reenovelamento feito por gradiente de uréia (8 – 0 M). A eluição da proteína foi feita sob condições nativas com 500 mM de Imidazol e a confirmação do reenovelamento da proteína recombinante foi feita pela técnica de espectroscopia de infravermelho (IR). A proteína purificada reenovelada foi utilizada na imunização de coelhos para a produção de antissoro policlonal. A análise do processo de purificação foi realizada através de SDS PAGE, mostrando um alto grau de pureza da amostra com a proteína purificada com massa molecular de ~31 kDa (26 kDa da proteína + 5 kDa da cauda de histidina do vetor) . As análises do reenovelamento feitas por IR indicaram a presença de estruturas secundárias tais como: 40% de folha-β, 11,5% de desordenada, 34,72% de hélice-α e 13,0% de voltas e folhas-β. O antissoro produzido reagiu eficientemente com a proteína purificada conforme análises feitas por Western blot. Estudos posteriores utilizarão a proteína purificada na determinação estrutural por cristalografia de raios-X e o antissoro policlonal em análises de imunolocalização em tecidos infectados.