| Área: Virologia ( Divisão P ) CONSTRUÇÃO DE UMA LINHAGEM DE SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM DRFAC DRFAF DRFAD E INTERAÇÃO DESTE MUTANTE COM BACTERIÓFAGOS LÍTICOS Gustavo Bueno Gregoracci (Unicamp); Guilherme Martines Teixeira Mendes (Unicamp); Marcelo Brocchi (Unicamp)
ResumoA terapia com bacteriófagos representa uma alternativa terapêutica e/ou preventiva redescoberta nas últimas décadas no combate a bactérias patogências, especialmente as multi-resistentes a antibióticos. No caso de Gram-negativos, a literatura sugere a necessidade de purificação parcial das preparações de fagos de contaminação por endotoxina (LPS). Alguns dos fagos de nosso laboratório, isolados contra Salmonella enterica Typhimurium UK1 e que demonstram potencial terapêutico, apresentaram-se refratários a todas as técnicas usuais de separação empregadas. Este trabalho visa construir um mutante dessa bactéria deficiente nas enzimas necessárias para a construção da cadeia lateral de LPS. Desta forma espera-se entender melhor a relação vírus bactéria e possivelmente se obter um hospedeiro para estes vírus com menor produção de LPS.
Utilizamos o sistema LambdaRed de recombinação sítio dirigida. Primers específicos foram desenhados a fim de substituir os genes alvo (rfaC, rfaF e rfaD) pelo gene de resistência cat (cloranfenicol acetil transferase) na linhagem alvo Salmonella enterica Typhimurium UK1. A amplificação dos genes alvo por PCR, a observação do padrão de bandas de LPS em gel de poliacrilamida (após oxidação), e verificação de infecção e titulações de quatro bacteriófagos líticos representam os testes empregados para detecção dos mutantes.
A recombinação homóloga dos genes alvo pelo marcador cat foi bem sucedida, conforme confirmado por PCR. As deleções modificaram a produção de LPS bacteriano, embora não abolindo completamente as bandas observáveis em gel. A infecção pelos quatro bacteriófagos testados foi completamente abolida nos mutantes.
Dois mutantes DrfaC DrfaF DrfaD cat+ da linhagem UK1 de S. enterica Typhimurium foram obtidos com sucesso.A modificação da cadeia lateral de LPS aboliu a infecção por alguns bacteriófagos líticos, prevenindo a produção destes vírus nestas linhagens. Inferimos, portanto, que a cadeia lateral de LPS representa o receptor destes bacteriófagos estudados o que explica o fracasso das tentativas prévias de purificação parcial destas preparações. Este achado abre a possibilidade do desenvolvimento de sistemas de afinidade que visem a purificação de LPS de preparações biológicas.
Palavras-chave: Bacteriófagos, LPS, mutante, Salmonella, Typhimurium |