CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES DA PAREDE CELULAR DE PARACOCCICIOIDES BRASILIENSIS

Larissa Valle Guilhen Longo (UNIFESP); Alisson Leonardo Matsuo (UNIFESP); Ernesto Nakayasu (UTEP); Luciane Ganiko (UTEP); Igor Correia de Almeida (UTEP); Rosana Puccia (UNIFESP)

A parede celular de fungos é uma estrutura complexa e dinâmica, essencial para a manutenção da célula, além de ser a principal estrutura de contato com o hospedeiro. Seus principais componentes são carboidratos, como as glucanas e as quitinas, seguidos de proteínas e lipídeos. As proteínas estruturais de parede celular de Candida albicans estão covalentemente ligadas às cadeias laterais de β-1,6-glucana via âncora de glisosilfosfatidilinositol (GPI) ou diretamente às cadeias de β-1,3-glucana. Manoproteínas podem ligar-se covalentemente à parede por pontes dissulfeto ou por ligações não-covalentes. Nosso grupo tem como objetivo identificar proteínas e lipídeos da parede celular do fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), que é patogênico no homem. No presente trabalho, usamos como modelo os isolados clínicos Pb3 e Pb18, os quais representam grupos filogenéticos distintos e provocam paracoccidiodomicose murina com características próprias. Os fungos foram cultivados na fase leveduriforme patogênica em meio definido glucosado na presença ou ausência de 2% de plasma humano. Preparações de parede celular foram obtidas após uma hora de lise celular em B. Braun, seguidas de centrifugação em sacarose 85% e lavagem. Inicialmente, proteínas ligadas por pontes dissulfeto foram extraídas através de duas lavagens com 50 mM de ditiotreitol em PBS por uma hora a 37ºC. Em seguida, duas extrações com solução 100 mM de Na-EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 7,8 e 2% de SDS por 5 minutos a 90ºC liberaram proteínas ligadas de forma não covalente. Proteínas covalentemente ligadas foram sequencialmente extraídas com NaOH 30mM a 4ºC por 16 horas e com solução 70% de HF em 30% de piridina por 3 horas em gelo. Proteínas de parede celular de células íntegras foram extraídas com 2 mM de DTT em 0,1M de fosfato de sódio, pH 8,0, a 4ºC por 1h. Frações lipídicas apolares foram obtidas após três extrações com CHCl₃:metanol (2:1, v:v), enquanto três extrações sequenciais com CHCl₃:metanol:H₂O (1:2:0.8, v:v:v) originaram frações lipídicas mais polares. A detecção e análise das proteínas e lipídeos estão sendo realizadas através das técnicas de cromatografia líquida/espectrometria de massas (LC-MS/MS) para proteínas e cromatografia gasosa/espectrometria de massas (GC-MS) para lipídeos. Os resultados comparativos serão apresentados no painel durante o congresso.