CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE ESTRUTURAS VESICULARES EXPORTADAS PELO FUNGO PATOGÊNICO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS

Milene Vallejo (UNIFESP); Alisson Matsuo (UNIFESP); Lia Medeiros (UFRJ); Kildare Miranda (UFRJ); Edna Freymueller (UNIFESP); Rita Sinigaglia-coimbra (UNIFESP); Ernesto Nakayasu (UTEP); Luciane Ganiko (UTEP); Igor Almeida (UTEP); Rosana Puccia (UNIFESP)

A importância de vesículas exocíticas como um mecanismo de secreção e transporte de moléculas imunomodulatórias, assim como sua relevância na relação parasita-hospedeiro foram reconhecidas em fungos como Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Neste trabalho, o fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis foi utilizado como modelo no estudo de estruturas vesiculares membranosas exportadas para o meio extracelular (exossomo-like). Foram comparados dois isolados de P. brasiliensis: Pb3, que representa o grupo filogenético PS2, e Pb18, representante do grupo S1 e amplamente utilizado na PCM experimental. Estes isolados provocam um perfil distinto de infecção em camundongos B10.A. Para isolamento das vesículas, as culturas foram inicialmente centrifugadas a 4.000 g por 15 min e 15.000 g (4^oC) por 30 min para remover células íntegras; os sobrenadantes livres de células foram filtrado em membrana estéril de 0,45 µm e concentrados utilizando membranas com limite de exclusão de 100 kDa. O concentrado foi submetido a uma ultracentrifugação por 1 h a 100.000 g a 4º C. O precipitado contendo vesículas foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, testes imunológicos e enzimáticos. Preparações de precipitados 100.000 g de Pb18 contêm estruturas vesiculares delimitadas por membranas com populações heterogêneas medindo de 20 a 200 nm. Foi observada imunomarcação com a lectina MOA e anti-α-galactosil (isolado de pacientes com doença de Chagas) na superfície e interior das vesículas e em células de Pb18. A reatividade diminuiu após o tratamento com α-galactosidase. Anti-α-galactosil também foi isolado de soro de pacientes com PCM. Western blot com soro de pacientes com paracoccidioidomicose revelou a presença de antígenos específicos de P. brasiliensis em preparações de vesículas. Nas mesmas preparações, foram detectadas atividades enzimáticas de lacase, fosfatase e urease de forma dose-resposta tanto em Pb18 como Pb3. Análises de proteínas e lipídios de vesículas estão sendo realizadas e os resultados serão apresentados no painel durante o congresso.