INTERAÇÃO ENTRE NS5 DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA E OUTROS FLAVIVIRUS COM A PROTEÍNA HUMANA EIF3L

Ana Theresa Silveira de Morais (FAMERP); Maria Carolina Ferrari Sarkis Madrid (FAMERP); Roberta Vieira Morais Bronzoni (FAMERP); Danilo Vilas Boas Duarte (FAMERP); Raphael Gonçalves Nicésio (FAMERP); Mariana Pela Sabbag (FAMERP); Cleslei Zanelli (UNESP-FCF); Sandro Valentini (UNESP-FCF); Maurício Lacerda Nogueira (FAMERP)

O vírus da febre amarela (YFV-yellow fever virus) pertence ao gênero Flavivirus e causa importante febre hemorrágica. A proteína não estrutural NS5 do vírus apresenta duas atividades essenciais durante a replicação viral, uma de RNA Polimerase dependente de RNA e outra de metiltransferase. Interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido estudadas para entendimento da replicação viral. Recentemente, um screening em sistema duplo-híbrido usando YF NS5 contra biblioteca de cDNA de células Hela foi realizado. A proteína humana eIF3L foi uma das que foram identificadas no screening. O objetivo desse estudo foi caracterizar, mapear e confirmar a interação da proteína NS5 com o fator de tradução eIF3L. Para demonstrar a interação do domínio RNApol com eIF3L através da ativação de genes repórteres, foi realizado ensaio em sistema duplo-híbrido em Sacharomyces cerevisae AH109, a qual foi transformada com os plasmídeos RNApol-pGBKT7 e eIF3L-pACT2. Deleções em NS5 mostraram que a interação ocorre numa região de 79 aminoácidos (Fragmento A) de RNApol, região conservada em outros Flavivirus. Para delimitar o domínio mínimo de interação entre RNApol e eIF3L, o FragA foi subdividido em três segmentos e em ensaios de duplo-híbrido foi mostrado que a interação ocorre no seu terço final. Com isso, mutações foram introduzidas no terço final do FragA para o mapeamento dos resíduos críticos na interação em ensaio de duplo-híbrido, mostrando que a interação é crítica numa região de 5 aminoácidos FWELV. Ensaios de GST-pulldown foram realizados em células Hela para confirmação da interação, eIF3L e FragA foram clonados respectivamente em vetores contendo etiqueta Flag e GST; a interação entre Fragmento A de RNApol e eIF3L foi confirmada por Western blotting. Usando RNA de interferência, suprimimos a expressão do RNA da proteína eIF3L em células LLC-MK2, para avaliação da sua função na replicação de YFV. Assim, pudemos observar que na ausência dessa proteína, há uma dimuição da replicação viral.