PURIFICAÇÃO PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE C DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ISOLADO DE ALPACAS

David Perez (UNMSM); Patrick Spencer (IPEN); Maisa Dellacasa (IBu); Christiane Ozaki (IBu); Júlia Nara (IBu); Sarita Rossato (IBu); Lenin Maturrano (UNMSM); Raul Rosadio (UNMSM); Denise Horton (IBu); Roxane Piazza (IBu)

Introdução: A fosfolipase C de Clostridium perfringens (Cp-PLC), também denominada toxina alfa é uma metalofosfolipase e possui várias atividades como hemolítica, de agregação plaquetária, citotóxica, miotóxica e letal. Sabe-se que a Cp-PLC é o fator de virulência responsável pela gangrena gasosa em humanos e casos suspeitos em patologias entéricas em muitas espécies de animais. Entretanto, o papel da Cp-PLC na enterotoxemia em alpacas, doença responsável por alta mortalidade de rebanhos no Peru, ainda não está esclarecido. Objetivo: O presente trabalho visa purificar Cp-PLC e avaliar suas principais atividades. Material e Métodos: C. perfringens, isolado a partir de casos de enterotoxemia em alpacas, foi cultivado em caldo BHI em condições de anaerobiose a 37° C por 17 horas. Após a centrifugação, o sobrenadante obtido foi submetido à precipitação seqüencial com sulfato de amônio a 50%, 85% e 100%. Após a diálise, as amostras foram analisadas quanto ao conteúdo de proteínas, perfil eletroforético em SDS-PAGE e atividade de lecitinase. As atividades hemolítica, agregação plaquetária, citotóxica em células HEp2 e letal foram também avaliadas. Resultados: A melhor condição de purificação foi obtida após precipitação com 50% de sulfato de amônio, que apresentou uma pureza de aproximadamente 12 vezes e um rendimento de 58%. A fração obtida após a precipitação com 85% de sulfato de amônio foi purificada 0.7 vezes, com 5.2% de rendimento. A fração obtida após 100% de sulfato de amônio não apresentou atividade. A fração parcialmente purificada apresentou uma atividade hemolítica de 640 u.a.h./mL e uma capacidade de agregação plaquetária de 80% em relação à produzida por ADP. O principal efeito citopático foi o alogamento celular, visualizado a partir de concentrações de 12.8 ate 0.8 u.a.y./mL, sendo bem evidente na concentração de 25.6 u.a.y./mL. As concentrações superiores ou iguais a 12.8 u.a.y./mL foram suficientes para provocar um efeito letal em camundongos. Conclusão: O presente trabalho descreve a purificação parcial de Cp-PLC de C. perfringes, por uma técnica simples e econômica, que permite manter sua atividade enzimática, o que possibilita empregá-la no estudo da patogênese da enterotoxemia em alpacas.