PERFIL PROTEÔMICO DE LEVEDURAS DE SPOROTHRIX SCHENCKII

Anderson Messias Rodrigues (UNIFESP); Cristiane Cândida do Amaral (UNIFESP); Alexandre Augusto Sasaki (UNIFESP); Priscila Oliveira dos Santos (UNIFESP); Geisa Ferreira Fernandes (UNIFESP); Zoilo Pires de Camargo (UNIFESP)

A esporotricose é uma infecção crônica granulomatosa subcutânea e polimórfica de humanos e animais e tem como agente etiológico o fungo termodimórfico Sporothrix schenckii. A micose é adquirida por inoculação traumática do patógeno, com raros casos de transmissão de pessoa para pessoa, sendo comum o relato de pacientes que tiveram contato prévio com felinos e tatus. Tendo em vista a sua importância clínica, à necessidade do melhor entendimento sobre sua biologia, objetivamos utilizar a técnica de eletroforese bidimensional para análise do antígeno celular de leveduras do S. schenckii. Utilizou-se um isolado de S. schenckii, obtido de paciente com manifestação fixa da esporotricose. As leveduras foram cultivas em meio BHI, pH 8,0, sob agitação constante durante 7 dias. As células foram coletadas por centrifugação e lavadas em água ultra-pura. Após a lavagem o pellet resultante foi macerado em nitrogênio líquido, ressuspenso em tampão Tris-Cálcio (20 mM Tris-HCl pH 8.8, 2 mM CaCl₂) e adicionado de inibidores de protease e nuclease (10 µL/mL). Aproximadamente 300 µg de proteínas foram precipitadas (2D Clean up kit), ressuspensas em 250 µL de tampão de reidratação (Uréia 7M, Tiouréia 2M, CHAPS 4%, IPG Buffer 2%, DStreak 1,2 %) e aplicadas em tiras de pH 3-10, 13 cm. A eletroforese em primeira dimensão foi realizada aplicando-se diferentes gradientes de corrente elétrica em uma unidade ETTAN IPGphor 3 até completar 55.000 Vhrs totais. Posteriormente à focalização isoelétrica, a tira foi reduzida (0,1% DTT) e alquilada (0,2% Iodoacetamida) em tampão de equilíbrio [6 M uréia, 0,375 M Tris HCl (pH 8,8), 20% glicerol, e 2% SDS]. A segunda dimensão foi realizada em cuba vertical, constando de um gel de separação linear a 10% de poliacrilamida, aplicando-se uma corrente eletroforética de 23 mA/gel.  Ao final da eletroforese, os géis resultantes foram corados com nitrato de prata. As leveduras de S. schenckii apresentam proteoma consideravelmente complexo, composto por aproximadamente 300 spots, os quais variam de acordo com a massa molecular de 20 a 120 kDa e pI de 3,77 a 10,0, sendo que a maioria das proteínas estão concentradas na faixa de pH de 4,05 a 7,73. Estudos do proteoma deste fungo podem ajudar a desvendar quais proteínas são importantes para os processos biológicos da fase parasitária. Apoio: FAPESP, CAPES e CNPq