CARACTERIZACAO DO GENE CLPB EM ENTEROCOCCUS FAECALIS

Naira Elane Moreira de Oliveira Oliveira (IMPPG-UFRJ); Jacqueline Abranches Abranches (COB-UR); Marinella Silva Laport Laport (IMPPG-UFRJ); Maria do Carmo de Freire Bastos Bastos (IMPPG-UFRJ); Jose Abelardo Lemos Lemos (COB-UR); Marcia Giambiagi-demarval Giambiagi-demarval (IMPPG-UFRJ)

O Enterococus faecalis é  um coco Gram-positivo que habita o trato gastrointestinal mas que também se apresenta como um importante patógeno em infecções nosocomiais. Este organismo possui resistência intrínsica e adquirida a múltiplos antimicrobianos, e é particularmente tolerante a uma grande variedade de estresses físico-quimicos.  Em resposta a estresses, as células bacterianas sintetizam proteínas pertencentes a família das Clp ATPases.  ClpB, um membro desta família, funciona principalmente como uma chaperona molecular, que atua assistindo proteínas desenoveladas ou desnaturadas. O objetivo deste trabalho é caracterizar o gene clpB, e avaliar sua participação na resposta ao estresse de E. faecalis OG1RF.  Análises "in silico" indicaram que o gene clpB de E. faecalis OG1RF possui 2607-pb e um potencial sítio de ligação ao regulador de estresse CtsR na região promotora.  A sequencia prevista do polipeptideo apresenta peso molecular de 98 kDa. Anticorpo policlonal anti-ClpB de Synechococcus sp., detectou duas formas da proteína ClpB. Marcações por pulso com ³⁵S-Met, mostraram a indução desta proteína a partir de 42°C, atingindo o ponto máximo de indução a 50ºC. Análise da expressão do gene clpB por "Northern blot" mostrou um único mRNA monocistrônico de 2,6 kb com aumentos de 10 e 35 vezes quando as células foram submetidas a temperaturas elevadas de 48° e 50ºC.  Analises, através de PCR em tempo real, confirmaram que a expressão de clpB é induzida durante o choque térmico ou na presença de sais biliares, NaCl e vancomicina.  Para estudar a função de ClpB em E. faecalis, foram construídas duas cepas mutantes através da inativação de clpB e ctsR (∆clpB e ∆ctsR). Comparação entre a linhagem selvagem e o mutante ∆ctsR mostrou, através de PCR em tempo real, um significativo aumento na expressão do gene clpB na ausência do repressor CtsR, confirmando que o gene clpB é regulado por CtsR.  Análises da cepa DclpB indicou que ClpB esta diretamente envolvida na aquisição de termotolerância, mas é aparentemente dispensável na resposta a outros estresses, tais como estresse oxidativo, alcalino e ácido. Nenhuma diferença significativa foi observada na formação de biofilme em DclpB quando comparado a cepa selvagem.  Estudos preliminares utilizando o modelo de virulência da larva de Galleria mellonella sugerem que ClpB pode estar envolvida na patogênese de E. faecalis.