EXPRESSÃO DO PEPTÍDEO TÓXICO JABURETOX DA LEGUMINOSA CANAVALIA ENSIFORMIS NO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO METARHIZIUM ANISOPLIAE

Ângela Junges (CBiot/UFRGS); Anne Helene Souza Martinelli (CBiot/UFRGS); Leonardo Broetto (CBiot/UFRGS); Juliano Tomazzoni Boldo (CBiot/UFRGS); Célia Regina Ribeiro da Silva Carlini (CBiot/UFRGS); Marilene Henning Vainstein (CBiot/UFRGS); Augusto Schrank (CBiot/UFRGS)

A capacidade de infectar inúmeros hospedeiros apresentada pelo fungo filamentoso M. anisopliae tornou-o um organismo modelo para o estudo da interação patógeno-hospedeiro. Este fungo é agente biocontrolador de insetos-praga da agricultura e uma alternativa à utilização de pesticidas químicos. No entanto, formulações da linhagem selvagem apresentam como fator limitante o lapso de tempo decorrido entre a adesão do esporo de M. anisopliae na cutícula de seu hospedeiro e a efetiva morte. Uma das maneiras de diminuir este lapso de tempo baseia-se no desenvolvimento de linhagens otimizadas que sejam capazes de matar o hospedeiro em períodos de tempo menores. Para atingir este objetivo o presente trabalho propõe a construção de uma linhagem de M. anisopliae expressando o peptídeo entomotóxico Jaburetox, oriundo de C.ensiformis. Deste modo, será avaliada a participação deste peptídeo no processo de infecção de M. anisopliae utilizando como hospedeiro o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus. Para permitir a expressão do peptídeo no fungo foi construído o vetor pTEF_JAB_TtrpC, o qual contém a seqüência nucleotídica referente ao peptídeo Jaburetox sob a regulação do promotor do gene tef-1-alfa e do terminador do gene trpC de Aspergillus nidulans. Após subclonagem do cassette de expressão de Jaburetox no vetor binário pPZP201BK, ao mesmo foi inserido o cassette de expressão do gene bar. Este gene codifica uma fosfinotricina acetiltransferase, a qual confere resistência à glifosinato de amônio e permite, portanto, a seleção de transformantes. O vetor pPZP_JAB_BAR foi utilizado para transformar células de Agrobacterium tumefaciens EHA105. A partir da agrotransformação de M. anisopliae foram obtidas 156 colônias resistentes a glifosinato de amônio (250ug/mL). Destas, 4 transformantes apresentando sinal de amplificação positivo foram cultivados em meio líquido para extração de proteínas intracelulares. A confirmação dos transformantes foi avaliada pela presença do peptídeo na fração intracelular do fungo detectada por ensaio de Western blot, no entanto, o peptídeo (~13KDa) parece estar formando agregados com tamanho superior a 30KDa. Através de bioensaios contra D. peruvianus será avaliada a eficiência de morte das linhagens recombinantes em comparação com a selvagem. Paralelamente, foi realizado por Genome walking, o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae. Estes elementos reguladores serão utilizados para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos.