OTIMIZAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MEGAPLASMÍDEOS DE PSEUDOMONAS SP. ENVOLVIDOS NA DEGRADAÇÃO DE HPAS

Fernanda Romanholi Pinhati (UFRJ); Ramon Gomes da Silva (UFRJ); Renata Kelly Leite Passos (UFRJ); Ana Paula Rodrigues Tôrres (CENPES PETROBRAS); Vânia Maria Junqueira Santiago (CENPES PETROBRAS); Joab Trajano Silva (UFRJ); Vânia Margareth Flosi Paschoalin (UFRJ)

Atualmente, os maiores problemas de poluição referem-se aos efluentes industriais, como os de refinaria de petróleo, que apresentam composição heterogênea, contendo várias substâncias que podem ter efeitos adversos sobre os seres vivos. Entre os compostos encontrados nesses efluentes, pode-se destacar os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), poluentes recalcitrantes com elevada toxicidade, geralmente descartados no meio ambiente como resultado do tratamento incompleto desses efluentes. Os genes responsáveis pelo mecanismo de degradação dos HPAs são frequentemente encontrados em plasmídeos, moléculas de DNA extracromossômica, com origem de replicação autônoma. Em um trabalho anterior, realizado em nosso laboratório, foram isoladas três linhagens de bactérias, a partir do lodo ativado, por cultivo em meios seletivos contendo apenas HPAs como única fonte de carbono. Estas linhagens foram classificadas pelo sequenciamento da região V3 do rDNA 16S como sendo diferentes espécies de bactérias do gênero Pseudomonas. O objetivo deste trabalho foi padronizar um protocolo de extração e purificação de DNA plasmidial utilizando gradiente de CsCl para analisar a informação genética necessária ao metabolismo dos HPAs. Inicialmente, a bactéria foi cultivada em meio LB e o DNA plasmidial foi extraído por lise alcalina com adição de lisozima (10mg/mL). O plasmídeo foi ressuspenso em tampão TE, ao qual foi adicionado CsCl (1,01g) e brometo de etídeo (10mg/mL). A solução foi transferida para tubo Quick Seal (Beckman) e ultracentrifugado a 60.000rpm por 24h (centrífuga Beckman modelo LK 90). A banda inferior de maior densidade, contendo o DNA plasmidial, visualizada por irradiação com lâmpada UV, foi recuperada por punção do tubo com agulha 18G, tratada com butanol e precipitada com etanol. A pureza da preparação foi confirmada por eletroforese em gel de agarose (0,7%), que mostrou que a preparação estava livre de vestígeos de DNA cromossomial e RNA. Os megaplasmídeos com tamanho molecular aparente superior a 23 kb serão caracterizados por análise de fragmento de restrição.CAPES/FAPERJ/PETROBRAS.