APLICABILIDADE DE UM ELISA IN-HOUSE PARA PARATUBERCULOSE BOVINA NO SORODIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE CROHN

Flávia Gabel Guimarães (IMPPG); Ana Carolina da Silva Carvalho (GED); Neio Lucio Fernandes Boéchat (IDT); Cyrla Zaltman (GED); Valéria Cristina Loureiro Salgado (GED); Carla Dray Marassi (IMPPG); Walter Martin Roland Oeleann (IMPPG)

Doenças inflamatórias intestinais, Doença de Crohn (DC) e Retocolite Ulcerativa (RC), são enfermidades idiopáticas caracterizadas por um forte processo crônico inflamatório. Compartilhando similaridades clinicas que, dificultam o diagnóstico diferencial entre elas, temos que aproximadamente 15% dos casos clínicos não são fechados. A paratuberculose Bovina é causada por Mycobacterium avium paratubrculosis (Map) e devido similaridades dos sinais clínicos, patológicos, epidemiológicos e testes diagnósticos positivos para Map em pacientes com DC, tem sido indicada como possível agente na DC. O presente trabalho  tem por objetivo a avaliação de um ELISA in-house para paratuberculose bovina como ferramenta para o imunodiagnóstico de pacientes com DC, quando comparado aos portadores de RC. Para este fim, o antígeno protoplasmático (PPA) de Map é adsorvido em poços da placa de microtitulação e testado com soro de doentes clinicamente confirmados com DC e RC, utilizando como controle negativo soro de pacientes com outras doenças intestinais não inflamatórias e de indivíduos saudáveis. Visando a adaptação do ensaio, desenvolvido pelo nosso grupo para pesquisa de anticorpos anti-Map em bovinos, diferentes condições foram testadas: 0,5, 1,0 e 5,0µg/poço de PPA; soros diluidos seriadamente (1/25 a 1/400, 1/25 a 1/800 e 1/100 a 1/3200) e; uso de diferentes conjugados como α-IgA/M/G ligado a peroxidase (HRP) (1/5.000, 1/20.000, 1/40.000 e 1/60.000)  e a proteína A de Staphylococcus aureus (1/10.000 e 1/20.000). Após a adição do substrato tetrametilbenzidina (TMB) em tampão citrato, ocorre uma reação colorimétrica, que é interrompida com HCl a 2N, seguida da leitura das absorbâncias em 450 nm. Verificamos com os diversos ensaios realizados que obtemos uma melhor distinção entre a população com DC e RC quando utilizamos o PPA padronizado em 1,0 µg/poço e os soros diluídos em 1/200, com α-IgA-HRP em 1/20.000, 1/800, com α-IgG-HRP em  1/60.000,  e 1/100 com proteína A em 1/20.000. O uso de α-IgM-HRP não se mostrou eficaz, apresentando valores muito próximos para as diferentes populações testadas. Além disso, foi possível verificar que em geral a população saudável obteve valores de densidade óptica superior à população com RC e inferior à com DC.