CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UMA PROTEÍNA PUTATIVA PARA ATIVAÇÃO DE PLASMINOGÊNIO EM BACTEROIDES VULGATUS

Livia Queiroz Ferreira (IMPPG UFRJ); Bruno Siqueira Dias (IMPPG UFRJ); Eliane de Oliveira Ferreira (IMPPG UFRJ); Edson R. Rocha (ECU); Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues (IMPPG UFRJ)

Bacteroides vulgatus é uma bactéria anaeróbia Gram negativa que reside no cólon humano, contabilizando aproximadamente 10 a 22% desta população bacteriana anfibiôntica. A microbiota intestinal apresenta participação significativa no desenvolvimento de quadros inflamatórios intestinais como à doença de Crohn e a colite ulcerativa, sendo B. vulgatus um dos microrganismos relacionados à evolução destes quadros. Dentre as espécies do gênero Bacteroides, a espécie B. fragilis é a mais isolada de quadros clínicos estando envolvidas em diversos quadros infecciosos, principalmente de peritonite e bacteriemia. Recentemente, uma proteína de membrana externa em B. fragilis capaz de ativar plasminogênio (Plg) humano foi descoberta em B. vulgatus. Esta característica já está bem discutida como fator de virulência para outros microrganismos como S. aureus, Streptococcus do grupo A, C e G e Y. pestis. O Plg é convertido na forma proteolítica a plasmina por ativadores eucarióticos como um tipo de tecido ativador do Plg (tPA) e a uroquinase, sendo este processo muito bem controlado durante a fibrinólise. Quando este processo é de alguma forma interrompido a disseminação bacteriana pode acontecer. Para B. vulgatus alguns trabalhos já associaram a sua capacidade de reconhecer e ativar o Plg a plasmina com o seu envolvimento na doença de Crohn, porém, tal característica permanece pouco estudada. Desta forma, o objetivo deste trabalho é clonar o gene responsável pelo reconhecimento do Plg (bvp60) na cepa ATCC 8482 de B. vulgatus através de técnicas de biologia molecular, para posterior caracterização desta proteína. Primeiramente, foi realizado o teste de ativação do Plg a fim de verificar se a cepa de B. vulgatus era capaz de reconhecer e ativar o Plg a plasmina. Neste ensaio a cepa em estudo foi incubada com Plg e, após 5 horas de incubação, foi possível observar a formação de plasmina através da revelação com um cromógeno. A partir daí, foi realizada a extração de DNA da cepa de B. vulgatus e a presença do gene bvp60 foi detectada através da PCR com iniciadores internos do gene. Em seguida, este gene foi clonado no vetor pGEM-T Easy e, posteriormente, no vetor suicida pFD516 para realização da técnica de conjugação triparental e posterior obtenção de mutantes. Algumas colônias foram selecionadas para confirmação da mutação no gene bvp60 através de PCR. Os mutantes já confirmados serão futuramente utilizados nos ensaios de ativação do Plg e em um modelo de indução de abscessos intraperitoneais de camundongos para melhor entender o papel desta molécula na patogênese de B. vulgatus. Para melhor caracterizar esta adesina, o gene bvp60 será também clonado no vetor pET26b⁺ nos sítios das enzimas de restrição XhoI/NdeI  para construção de uma proteína recombinante. Após a expressão, a proteína recombinante será purificada em coluna de Níquel e ensaios in vitro serão realizados para verificar se a proteína ativa o Plg.