| Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N ) EXPRESSÃO DE GENES DO COMPLEXO-AGULHA DE ESCHERICHIA COLI DE ADESÃO DIFUSA (DAEC)
Marina Heckmann Bove (UnB); Márcio Mandelli Lorenzoni (UnB); Cynthia Maria Kyaw (UnB)
ResumoO Sistema de Secreção do Tipo Três (TTSS), responsável por translocar proteínas efetoras diretamente para o citoplasma da célula hospedeira, é um forte indicador de virulência, sendo encontrado em linhagens de Escherichia coli enteropatogênicas (EPEC) e enterohemorrágicas (EHEC). As E. coli de Adesão Difusa (DAEC) constituem um terceiro grupo de E. coli diarreiogênicas, cuja patogenicidade ainda é controversa, devido a resultados conflitantes apresentados por diferentes estudos epidemiológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo de pesquisa encontrou prováveis genes TTSS em isolados de DAEC recuperados de crianças diarréicas e, neste trabalho, analisamos se esses prováveis genes eram de fato expressos. Para tal, a expressão dos genes TTSS do controle positivo EPEC E2348/69 e de seus homólogos em DAEC foi induzida por meio do crescimento dessas bactérias, por diferentes tempos, em meio LB tamponado. O controle consistiu no tempo zero, definido pela inoculação das bactérias no meio LB tamponado seguido imediatamente de centrifugação. A seguir, os RNAs dos isolados testados foram extraídos, tratados com DNase e utilizados em experimentos de RT-PCR. Os cDNAs produzidos foram então empregados em ensaios de PCR, com iniciadores direcionados aos genes do operon LEE4 escF, espA e espD e espB, que codificam a agulha, a bainha da agulha e os póros de translocação do complexo-agulha, respectivamente. Como controles positivo e negativo foram utilizadas amostras de cDNA e RNA, dos três isolados testados, com iniciadores direcionados ao gene que codifica a enzima da via glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, de expressão constitutiva. Os produtos obtidos nas PCRs foram analisados em géis de agarose corados com brometo de etídeo. A análise permitiu concluir que houve transcrição dos possíveis genes escF e espA de C39 e C74 e do provável gene espD de C39, e que essa transcrição foi dependente do crescimento das bactérias em LB tamponado. Tais resultados, aliados à informação de os genes analisados serem transcritos apenas quando a base do complexo-agulha já está montada, são fortes evidências de que os dois isolados de DAEC testados de fato possuem um TTSS funcional, cujos genes são transcritos sob indução. Assim, este trabalho fornece evidências que corroboram a virulência do patotipo DAEC e sua associação à diarréia em crianças.
Palavras-chave: complexo-agulha, TTSS, DAEC, RT-PCR |