CALPAÍNAS EM PHYTOMONAS SERPENS: DETECÇÃO E EFEITO DO INIBIDOR MDL28170 NA PROLIFEREÇÃO DO PARASITO

Michel Gomes Chagas (IMPPG - UFRJ); Fernanda de Alquino Marinho (IMPPG - UFRJ); Leandro Stefano Sangenito (IMPPG - UFRJ); Claudia Masani D'avila Levy (IMPPG - UFRJ); André Luiz Souza dos Santos (IMPPG - UFRJ); Marta Helena Branquinha de Sá (IMPPG - UFRJ)

O tripanossomatídeo Phytomonas serpens infecta tomates, causando manchas amareladas na superfície do fruto, o que diminui o seu valor comercial. Um novo alvo para o controle dessas infecções é o estudo das calpaínas, uma família de cisteína-peptidases neutras dependentes de cálcio. O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 sobre a proliferação de P. serpens, assim como avaliar a presença de homólogos de calpaínas. O parasito foi cultivado em meio BHI na presença do inibidor MDL28170, utilizado em concentrações de 15, 30, 45 e 60 µM. O efeito do inibidor foi avaliado pelo cultivo por 4 dias a 28ºC, e as células estimadas diariamente por contagem em câmara de Neubauer, comparando-se com o cultivo do microorganismo na ausência da droga. Realizou-se então o cultivo do microorganismo em concentrações crescentes do inibidor, até obter-se uma população de células resistentes à concentração de 30µM. Em seguida, as duas populações de células foram fixadas e incubadas com diluições dos anticorpos anti-Dm-calpaína (específico para a região C-terminal de calpaína de Drosophila melanogaster) e anti-CAP5.5 (específico para calpaína de Trypanosoma brucei), para análise em citômetro de fluxo. Os resultados mostraram que o parasito é susceptível ao inibidor MDL28170, que inibiu a proliferação do parasito em 17,68% quando utilizado na concentração de 15µM, e em 92,6% quando utilizado na concentração de 60µM ao fim de 96 horas, tendo a mesma droga demonstrado um efeito estático sobre as células. A análise em citômetro de fluxo demonstrou que os dois tipos celulares possuíam diferentes perfis de expressão de calpaínas, observando-se uma maior marcação nas células selvagens do que nas resistentes ao inibidor MDL28170. Estes dados indicam a ação dose-dependente do inibidor sobre a proliferação de P. serpens, além da capacidade do parasito em modular a expressão destas enzimas como um mecanismo de escape à presença do inibidor. As próximas etapas do projeto visam verificar alterações morfológicas nas células tratadas com os inibidores, a avaliação do efeito inibitório de outros inibidores de calpaínas, e a constatação de alterações na interação do parasito com a glândula salivar e intestino dissecados do inseto vetor após o tratamento com o inibidor.