PERFIL DE ÁCIDOS MICÓLICOS DE NOVAS ESPÉCIES DE MICOBACTÉRIA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Carlos Adam Conte Junior (UFRJ); Lígia Vieira Paula (UFRJ); Leone Vinícius Furlanetto (UFRJ); Eduardo Eustáquio de Souza Figueiredo (UFRJ); Giselli Fernandes Asensi (UFRJ); Walter Lilenbaum (UFF); Joab Trajano Silva (UFRJ); Vânia Margaret Flosi Paschoalin (UFRJ)

A identificação de Mycobacterium sp através do perfil de ácidos micólicos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi descrita desde a década passada. A padronização desta metodologia foi publicada, em 1996, pelo CDC (Centers for Disease Control and Prevention) como ferramenta padrão na análise e identificação de linhagens de micobactérias. Apesar de ter sido publicada outra versão pela mesma instituição, em 1999, esta, atualmente, não contempla todas as espécies de micobactérias que vem sendo isoladas e identificadas nos últimos anos. O objetivo deste estudo foi validar a técnica de identificação de micobactérias por meio da análise dos seus ácidos micólicos por CLAE e estabelecer os perfis de ácidos micólicos de espécies de micobactérias ainda não relatadas pelo CDC. Foram utilizadas cepas de referência M. flavescens ATCC14474, M. tuberculosis M37RV, M. vaccae ATCC15483, M. fortuitum ATCC6841, M. intracellulare ATCC13950 e M. bovis INCQS0062. As cepas foram crescidas em meio Lowenstein-Jensen e as células foram tratadas com NaOH a quente para saponificação dos ácidos micólicos ligados à parede celular. Os ácidos micólicos foram extraídos com clorofórmio e derivatizados a ésteres de p-bromofenacil. Os ésteres de ácidos micólicos foram separados por CLAE (Shimadzu, mod. LC-20AT) equipado com detector de arranjo de fotodiodos a 260nm (mod. SPD-M20A) e coluna de fase reversa C18 (Kromasil - 100mm x 4,6mm x 3,5mm) usando um gradiente de metanol (A) e diclorometano (B) (98:2) durante 1 minuto com gradiente linear até alcançar 80%A e 20%B. Nos próximos 9 min foi usado gradiente linear de 35%A e 65%B. Em continuidade, o gradiente retornou a 98%A e 2%B equilibrando a coluna por 5 min. As cepas de referência de M. tuberculosis, M. intracellulare, M. fortuitum e M. bovis apresentaram perfis cromatográficos similares aos descritos pelo CDC, validando a metodologia em nosso laboratório e nas condições utilizadas. Além das espécies referenciadas pelo CDC, outras espécies, como M. flavescens ATCC14474 e M. vaccae ATCC15483 tiveram seus perfis de ácidos micólicos estabelecidos, criando um padrão de referência para o estudo do perfil de ácidos micólicos dessas espécies. A identificação de espécies de micobactérias através da análise de ácidos micólicos por CLAE mostrou ser uma metodologia rápida, eficiente e confiável para a identificação e o estudo da prevalência de Mycobacterium sp.