Resumo

YPR116w é uma ORF (“Open Reading Frame”) de Sacharomyces cerevisiae cuja deleção leva a uma alta instabilidade do DNA mitocondrial (mtDNA). Diversos processos como montagem da ATP sintase, metabolismo de cardiolipinas e síntese protéica mitocondrial afetam indiretamente a manutenção do mtDNA. Nosso laboratório tem se dedicado ao estudo funcional de algumas ORFs que apresentam este fenótipo pleiotrópico. Especificamente, YPR116w codifica uma proteína mitocondrial com face voltada para a matriz, a qual parece estar complexada com os produtos gênicos de YLR091w e YDR065w, ambos sem função específica, PET130, proteína requerida para o crescimento respiratório e RPM2, única com papel bem caracterizado como subunidade da RNAse P mitocondrial. O estudo destes mutantes instáveis é facilitado através da geração de alelos condicionais sensíveis a temperatura (ts). Todavia, mesmo dispondo dos alelos ts para YPR116w, não conseguimos identificar nenhuma atividade respiratória mitocondrial, ou de montagem dos complexos respiratórios, através de análises bioquímicas. Porém, verificamos que a inserção de múltiplas cópias de YLR091w através de transformação do mutante ts de YPR116w aumentou a estabilidade do mtDNA, o que indica uma possível atividade correlacionada. Com o objetivo de se tentar entender a função dos parceiros genéticos em estudo, os quais também possuem mtDNA instável, e posteriormente correlacioná-la com a atividade de Ypr116p, foram gerados mutantes ts para estes genes. Desta forma, realizamos a mutação na sequência da ORF/gene através de PCR propenso a erro, na presença de MnCl₂. Os amplicons gerados foram clonados em vetor centromérico. O “pool” de plasmídeos foi transformado no mutante para determinada ORF/gene. As colônias geradas foram testadas a 30^oC (condição permissiva) e 37^oC (condição restritiva), em meio de cultura contendo fonte de carbono não fermentável – etanol/glicerol. Para a confirmação dos resultados, fizemos a extração do plasmídeo dos candidatos a mutante ts, repetimos a transformação e as análises de crescimento. Os mutantes ts foram obtidos com sucesso e sua utilização irá contribuir com os estudos para a determinação da função de Ypr116p. Apoio Financeiro: FAPESP.