Resumo

Introdução: A identificação das ETEC é realizada pela detecção de seus principais fatores de virulência: as enterotoxinas termo-lábil (LT) e termo-estável (ST), através de técnicas de biologia molecular ou ensaios imunossorológicos, sendo que os ensaios imunossorológicos se destacam por serem rápidos, de fácil execução, incluindo alta especificidade e sensibilidade. Entretanto, para estas técnicas, faz-se necessário a utilização de anticorpos, sejam eles policlonais ou monoclonais. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes é uma alternativa viável para produção em larga escala e devido ao baixo custo. Objetivo: Produção de scFv contra a toxina ST de ETEC, e utilizá-los para propor um teste imunossorológico para diagnóstico destas bactérias. Materiais e Métodos: Partimos de um gene sintético, com otimização de códons para expressão em cepas de Escherichia coli. Esse gene foi amplificado no vetor de clonagem pGEM-T Easy (Promega) e subclonado em vetor de expressão pET28a (Novagen). Células E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o plasmídio recombinante e induzidas com IPTG em meio 2YT para sua expressão. Com os anticorpos purificados e com a sua atividade comprovada por ELISA, 43 isolados de ETEC produtoras da toxina ST foram testadas, sendo estes isolados provenientes tanto de humanos quanto de porcos. Resultados: Através da análise por SDS-PAGE e por Immunoblotting foi possível verificar que a fração insolúvel continha grande quantidade do fragmento de anticorpo. Portanto esta foi submetida a cromatografia em coluna de afinidade ao Níquel em sistema de alta pressão (AKTA) na presença de ureia, seguida de uma etapa de refolding. A concentração deste anticorpo foi dosada e a pureza analisada por SDS-PAGE. Foi realizada uma caracterização posterior quanto a sua funcionalidade através de ensaios imunossorológicos, como imunofluorescência e ELISA. A molécula se apresentou funcional e sem reatividade com os controles negativos. Quanto ao teste de reatividade aos isolados de ETEC, o scFv apresentou reatividade tanto para amostras humanas quanto as porcinas, se mostrando assim uma ferramenta promissora para ser utilizada no diagnóstico de ETEC.