Resumo

A criptococose é uma doença infecciosa fúngica potencialmente fatal, cosmopolita, que acomete mamíferos domésticos, animais silvestres e o homem; os sintomas clínicos podem variar de infecção pulmonar assintomática à doença disseminada e meningite. A criptococose é causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo C. neoformans e C. gattii as espécies clinicamente mais importantes. Estas acometem principalmente pacientes imunossuprimidos, entretanto C. gattii pode causar doença também em indivíduos imunocompetentes. Neste trabalho foi padronizada uma reação de amplificação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para a identificação de C. neoformans e C. gattii tendo como alvo a região IGS1 (intergenic spacer 1) do rDNA. Sequências correspondentes à região IGS1 de C. gatti e C. neoformans foram buscadas no GenBank e, após a análise, foram deduzidas as sequências consensos, utilizadas para a síntese dos oligonucleotídeos iniciadores CnIGS1-F/R, e CgIGS1-F/R específicos para C. neoformans e C. gattii, respectivamente. As cepas C. neoformans ATCC 66031 e C. gattii ATCC 56990 foram utilizadas como referência para os ensaios. Inicialmente, o DNA genômico foi obtido de células em fase de crescimento exponencial, e quantificado por espectrometria a 260/280 nm. A reação foi realizada usando 100 ng de DNA como molde, Platinum Quantitative SuperMix-UDG kit, oligonucleotídeos iniciadores; as amostras foram corridas em um termociclador Rotor Gene 6000. Foram realizados 35 ciclos com a temperatura de hibridação de 70 °C. As curvas de dissociação (melting curve) foram geradas em ambas as corridas, entre 60 °C e 95 °C, com um aumento de 0,5 °C/segundo, para observação dos picos de dissociação. Os resultados mostraram dois diferentes picos de dissociação: 82,8 °C e 84,2 °C para C. gattii e C. neoformans, respectivamente. Não foi observada amplificação cruzada quando DNA total, de C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, H. capsulatum, T. rubrum, S. schenckii, P. brasiliensis ou H. sapiens foi utilizada na PCR. Em conclusão, a amplificação por PCR em tempo real foi específica, permitindo a identificação de ambos os fungos, mostrando que a região IGS1 apresenta polimorfismo, podendo ser usada como um marcador molecular. Assim, os oligonucleotídeos iniciadores desenhados podem ser utilizados na identificação de C. neoformans e C. gattii.