XXI ALAM
Resumo:933-1


Poster (Painel)
933-1Obtenção de anticorpos monoclonais recombinantes de cadeia única (ScFv) contra a toxina Stx2 para sua utilização como ferramenta no imunodiagnóstico de Escherichia coli produtora da toxina de Shiga
Autores:Daniela Eleuterio da Luz (IBU - Instituto Butantan) ; Andrea Queiroz Maranhão (UNB - Universidade de Brasília) ; Roxane Maria Fontes Piazza (IBU - Instituto Butantan)

Resumo

As linhagens de Escherichia coli produtora da toxina de Shiga (STEC/EHEC) são importantes causadoras de diarreia, podendo também causar colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica, que pode levar a sequelas renais e até a morte. Em relação ao seu diagnóstico, é caro e demanda mão de obra especializada e tempo, o que muitas vezes acarreta a um tratamento inadequado, como o uso de antibióticos, que por fim, piora o quadro do paciente. Este trabalho tem como objetivo obter, utilizando a tecnologia dos anticorpos recombinantes, fragmentos ScFv contra a toxina Stx2 para sua utilização no diagnóstico rápido de linhagens de STEC/EHEC, afim de determinar o melhor tratamento de maneira rápida e eficaz. As cadeias leves e pesadas de anticorpos de camundongos foram obtidas - utilizando iniciadores degenerados específicos para a uma porção do arcabouço das cadeias variáveis de IgG - a partir do cDNA retrotranscrito do RNAm extraído de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra a toxina alvo. As sequências das cadeias variáveis após confirmada foi utilizada como molde para o desenho do gene sintético do anticorpo recombinante visando a clonagem em três distintos vetores de expressão (pAE, pIg16 e pSMT3), testes de expressão foram feitos em meio 2YT. Os CDRs das cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo recombinante foram identificados com sucesso, e o alinhamento com sequências germinal de camundongo mostrou que se tratava de cadeias funcionais. As clonagens nos vetores de expressão pAE e pIg16 foram bem sucedidas e confirmadas por sequênciamento e análise de restrição. Os testes de expressão mostraram a presença do fragmento de anticorpo tanto na fração solúvel quanto na insolúvel para ambas as construções, o que foi confirmado por immunoblotting utilizando anticorpo contra a cauda de histidina inserida pela clonagem nos vetores. Estas frações serão submetidas a cromatografia de afinidade ao níquel para a purificação e obtenção do anticorpo recombinante. A obtenção desse anticorpo recombinante será uma ferramenta promissora no diagnóstico rápido desse patótipo diarreico, podendo assim diminuir o número de mortes e complicações causadas pelo diagnóstico tardio ou incorreto dessa linhagem bacteriana, já que esses fragmentos de anticorpos possuem vantagens por serem produzidos em bactérias (o que diminui os custos) e serem específicos e sensíveis ao antígeno em questão.


Palavras-chave:  ScFv, STEC, Imunodiagnóstico, EHEC, Anticorpos