Resumo

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Em nosso laboratório obtivemos um anticorpo monoclonal anti-intimina que foi caracterizado como IgG2b e 1 μg desse anticorpo reconheceu 0,6 μg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M no entanto, esse anticorpo monoclonal mostrou menor reatividade frente a isolados de EPEC e EHEC do que os anticorpos policlonais, esse fato levou-nos a obtenção do anticorpo recombinante anti-intimina (scFv-intimina). As cadeias leves e pesadas de anticorpos de camundongos foram obtidas por iniciadores randômicos a partir do cDNA de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra a proteína alvo, essas sequências foram clonadas no vetor pGEMT-Easy e sequenciadas, para confirmar sua correta amplificação, e posteriormente as cadeias foram unidas por um linker peptídico obtendo-se assim os fragmentos scFv sintético. O scFv obtido foi clonado nos vetores de expressão pAE e pSMT3, transformado em linhagem de E. coli BL21(DE3), submetido à indução protéica e após a análise da melhor expressão proteica, observou-se que ambos os vetores direcionaram o scFv-intimina para corpúsculo de inclusão. Dessa forma, escolhemos o vetor pAE para expressar e purificar o anticorpo recombinante. Uma vez purificado essa importante ferramenta será utilizada na padronização de um método diagnóstico eficaz e rápido para detecção de EPEC e STEC.