Resumo

Introdução: A apresentação de proteínas ou peptídeos na superfície das células microbianas tem uma ampla gama de aplicações biotecnológicas, incluindo o desenvolvimento de vacina viva; bioabsorventes para a remoção de substâncias químicas tóxicas e metais pesados; biocatalisadores e biossensores com enzimas acopladas ou outros receptores sensíveis à sinais e para serem utilizados no screening de bibliotecas de peptídeos ou proteínas. Vários sistemas de apresentação de proteínas na superfície celular têm sido descritos na literatura. A maioria deles é baseada em domínios de ancoragem presentes em proteínas de membrana externa, lipoproteínas, proteínas secretadas ou subunidades de apêndices das bactérias. Objetivos: O objetivo deste estudo foi a construção de um sistema de expressão heteróloga de lipoproteínas na superfície de E. coli, utilizando a sequência codificante do peptídeo sinal de lipoproteínas (Lpp), o sítio de reconhecimento para a peptidase sinal (LSP) da principal lipoproteína de E. coli. Métodos: Quatro oligonucleotídeos foram sintetizados, anelados e ligados, originando a sequência codificante do Lpp, do sítio LSP, da cisteína e do “localizador” da proteína recombinante na membrana externa de E.coli. Cinco sítios de restrição foram incluídos para fornecer um sítio múltiplo de clonagem. O inserto obtido foi transferido para o vetor de expressão pET-37b(+) a partir de digestões com as enzimas NdeI e XhoI, originando o vetor para expressão de lipoproteína nomeado pLIPO. Para testar a capacidade desse sistema em expressar lipoproteínas heterólogas, cinco genes que codificam prováveis lipoproteínas de membrana externa da Leptospira interogans sorovar Copenhageni foram clonados no pLIPO. As lipoproteínas recombinantes foram expressas e caracterizadas através do ensaio de inibição da síntese de lipoproteínas utilizando globomicina e a expressão na superfície foi detectada pela análise por citometria de fluxo. Resultados e Discussão: Os resultados demonstraram que as regiões maduras das quatro lipoproteínas de leptospira clonadas no vetor pLIPO foram expressas, lipidadas e expostas na superfície de E.coli. Este sistema de apresentação de proteínas na superfície celular pode potencialmente ser aplicado para a caracterização funcional das lipoproteínas, que são importantes componentes estruturais e funcionais de bactérias. Financiado por CNPq e FAPESP.