Resumo

Um método de baixo custo baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em flocos de lodo ativado. Para analisar os microorganismos ativos foi utilizada a técnica de extração de rRNA seguida de reação de transcriptase reversa para obtenção do cDNA, amplificação por PCR e clonagem. Adaptações dos protocolos foram necessárias para realizar a extração de lodo ativado, sendo testados protocolos baseados em lise química, enzimática e física, nos quais os métodos de lise por cisalhamento mecânico foi o mais eficaz para lodo, porem após a lise da bactéria houve degradação do RNA, sugerindo algum tipo de interferência na extração, possivelmente a degradação do RNA pelas RNAses presentes no lodo ou a adsorção ou interferência por outras substâncias, como, por exemplo, substâncias húmicas, essa ultima pode comprometer a reação de PCR inibindo a amplificação. A adição de DEPC antes da lise bacteriana levou a proteção do RNA, sendo indispensável seu uso para a extração, sabendo-se que há presença de substâncias húmicas nas amostras de lodo. Assim como a necessidade da implementação de EDTA que é um agente quelante de íons metálicos, para a inativação das RNAses, e também a otimização da concentração de cobalto de hexamina para uma melhor precipitação do RNA. Na etapa de PCR foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de moldes. O reagente cloreto de magnésio teve sua concentração aumentada devido à otimização da extração de RNA, competindo pelo mesmo sítio de ligação na polimerase. Diante desse problema houve a necessidade do aumento da concentração de EDTA de 1 mM para 50 mM no tampão de ressuspensão TE, fazendo com que o cobalto pudesse ser quelado pelo EDTA. O armazenamento do lodo a -20 °C e -80ºC por 7 dias não levou a alterações expressivas em sua composição, já a armazenagem em 4ºC ocasionou degradação do RNA. A redução do número de ciclos do RT-PCR diminuiu o viés em relação à proporcionalidade dos microrganismos presentes na amostra, fazendo com que a técnica de clonagem retornasse resultados mais confiáveis. Após uma terceira digestão com a enzima de restrição Bhs1236I, podemos confirmar que duas digestões com enzimas simultâneas são o suficiente para identificar os agrupamentos ≥ 3%.