Resumo

Introdução: O Brasil apresenta a terceira maior taxa de resistência a fluorquinolonas na América Latina. A redução da sensibilidade às fluorquinolonas, mediada por proteínas Qnr, pode facilitar a sobrevivência de mutantes com substituições na região QRDR em gyrA que causam elevados níveis de resistência à ciprofloxacina. Objetivo: Avaliar a frequência de genes qnr em E. coli com elevados níveis de resistência à ciprofloxacina. Material e Métodos: Foram selecionadas 47 amostras de E. coli resistentes à ciprofloxacina isoladas de hemoculturas. O DNA foi extraído com Illustra Bacteria Genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare®). Para as reações de PCR foram utilizados os oligonucleotídeos qnrB2-3L 5’AAAGCCGACCGGGAAAATTG e qnrB-multF 5’CGACCTKAGCGGCACTGAAT e a Phusion® DNA polymerase (Thermo Scientific) para amplificação de um fragmento de 1100 pb com um ciclo térmico de 98°C por 30s; 35 ciclos de 98°C por 10s, 68°C por 20s, 72°C por 1 min; e extensão final a 72°C por 7 min. Os primers qnrB2-5L 5’TTGGCGGATTTGACGCATAAC e qnrB-multR 5’GAGCAACGAYGCCTGGTAGYTG foram utilizados para amplificar um fragmento de 750 pb empregando-se a Platinum Taq DNA Polymerase® (Invitrogen), com um ciclo térmico de 94°C por 5 min; 35 ciclos de 94°C por 1 min, 55°C por 50s, 72°C por 1:30 min; e uma extensão final a 72°C por 7 min. Os produtos de PCR foram purificados com o kit GFX e sequenciados com o kit BigDye® Terminator Cycle Sequencing de acordo com instruções do fabricante. As sequências de nucleotídeos foram comparadas com aquelas disponíveis no GenBank utilizando-se o programa BLAST. A avaliação do perfil plasmidial foi realizada segundo a descrição de Birnboim e Doly. Resultados e Discussões: Dentre as 47 amostras de E. coli resistentes à ciprofloxacina utilizadas neste estudos, 42,5% apresentaram o fragmento correspondente ao gene qnrB (n=20). Após sequenciamento de DNA e análise das sequências nucleotídicas, observou-se que seis isolados clínicos apresentaram duas sequências distintas do gene qnrB na mesma amostra, sendo que estas apresentaram perfis plasmidiais diferentes. Quando esses isolados foram amplificados com os oligonucleotídeos qnrB2-3L e qnrB-multF, observou-se 99% de similaridade com o gene qnrB2, porém, quando amplificados com os oligonucleotídeos qnrB2-5L e qnrB-multR, houve 99% de similaridade com o gene qnrB19. Conclusão: Foram observados seis isolados clínicos com perfis plasmidiais diferentes e presença concomitante de genes qnrB distintos na mesma amostra.