Resumo

Introdução: Batrachochytrium dendrobatidis é um fungo do filo Chytridiomycota que causa a quitridiomicose em anfíbios. Descrito em 1998, este agente coloniza as células epiteliais, se nutre da queratina e impede a realização das funções vitais, levando o animal a óbito. Devido à essas características o fungo está intimamente relacionado com o declínio das populações e processos de extinções de anfíbios em todos os continentes e, por isso, trata-se de uma doença emergente. Os sinais clínicos da infecção podem não estar presentes ou são observados somente próximos ao óbito. Por isso, durante a última década, técnicas de Biologia Molecular têm sido aprimoradas para a padronização do diagnóstico, além de utilizar métodos não invasivos. Material e métodos: Coleta das amostras: Um swab estéril é friccionado por toda a região ventral do animal e membros inferiores, evitando-se contaminação cruzada, sendo em seguida armazenados em tubos individuais sob refrigeração; Extração de DNA: Utiliza-se o reagente Prepman&trade Ultra (Applied biosystems); Reação de PCR: A amplificação do material extraído é realizada em termociclador, por meio de PCR convencional, com os primers Bd1a 5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3' E Bd2a 5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3' através do seguinte programa: - desnaturação a 93ºC por 10 minutos; - 30 ciclos de 45 segundos a 93ºC, 45 segundos a 60ºC e 1 minuto a 72ºC; - extensão final de 10 minutos a 72ºC. Um controle positivo é incluído em todas as reações. O amplificado é submetido à reação de eletroforese em gel de agarose 1% junto com um marcador de peso molecular e, para visualização das bandas, o gel de agarose é corado. Bandas com 300 bp serão consideradas positivas. Cultivo e isolamento: Para os anfíbios que vierem a óbito e forem submetidos à necropsia, fragmentos de pele serão analisados ao microscópio, cultivados em ágar e, se positivos, o PCR é analisado. Discussão e conclusão: Até o presente foram obtidas 200 amostras para diagnóstico molecular de quitridiomicose. Essas amostras foram obtidas de animais da população da Fundação Parque Zoológicos de São Paulo (FPZSP) e de projetos de conservação. Com a padronização do diagnóstico molecular de quitridiomicose é possível avaliar a sanidade dos animais mantidos pela FPZSP, aprimorar o programa de quarentena de anfíbios e dar suporte aos projetos de conservação desses animais através de parcerias, colaborações e até mesmo prestação de serviços.