Resumo

Alfa-galactosidases (EC 3.2.1.22) catalisam a hidrólise de terminais α-1,6-galactosil em galacto-oligossacarídeos e galacto-mananas, possuindo diversas aplicações biotecnológicas como: hidrólise de fatores anti-nutricionais em alimentos derivados de soja e em ração animal; produção de biomassa e/ou etanol a partir do melaço de soja; tratamento da doença de Fabry’s e conversão de grupos sanguíneos para doação. D. hansenii UFV-1 produz uma α-gal extracelular com propriedades catalíticas importantes para aplicação biotecnológica, destacando-se a alta atividade específica sobre rafinose, atuação em ampla faixa de pH e alta estabilidade térmica. Estudos biofísicos e estruturais da α-gal UFV-1 podem contribuir para o entendimento dos atributos enzimáticos que potencializam sua aplicação. O presente trabalho teve por objetivo clonar, expressar e purificar a enzima α-gal UFV-1 no sistema heterólogo de P. pastoris e caracterizar estruturalmente a enzima recombinante. Para tanto, ao gene da α-gal extracelular de D. hansenii UFV-1 foi adicionada sequência codificadora de cauda de histidina na porção N-terminal e o gene, sintetizado quimicamente, foi clonado no vetor pPICZαB (Invitrogen). P. pastoris recombinantes foram submetidas a ensaio de expressão em meio BMMH e a α-gal UFV-1 recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade ao níquel seguida de gel filtração. O perfil de gel filtração apresentou um pico principal, relativo a um oligômero com peso molecular estimado de 200 kDa, e cuja análise de espalhamento dinâmico da luz sugere um estado monodisperso. De acordo com o espectro de massas obtido por MALDI-TOF os monômeros glicosilado e deglicosilado possuem massas moleculares estimadas de 60 e 48 kDa, respectivamente. A análise de dicroísmo circular mostrou que a α-gal recombinante está enovelada e possui padrão de estrutura secundária similar àquele observado para outras alfa-galactosidases. Curvas de SAXS da α-gal UFV-1 mostram que a proteína apresenta-se como um tetrâmero (240 kDa) monodisperso em solução. Estes resultados abrem perspectiva para a cristalização e estudo da estrutura tridimensional da enzima de interesse biotecnológico α-gal UFV-1. Suporte financeiro: CNPq, CNPEM e FAPEMIG