Resumo

A leptospirose, causada por bactérias do gênero Leptospira, é um problema de saúde pública de importância mundial. Nos últimos anos tem-se identificado componentes imunogênicos para serem usados em testes para diagnóstico e vacinas contra a doença. Ensaios utilizando IgY, anticorpo de aves extraído de ovos de galinha, são desejáveis, visto que esta molécula é segura, eficiente, estável e de fácil purificação. Recentemente, nosso grupo realizou a produção e caracterização de anticorpos IgY contra rLipL32, um antígeno majoritário de leptospiras patogênicas. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi conjugar os anticorpos produzidos à isotiocianato de fluoresceína (FITC) e avaliar seu uso para detectar leptospiras. Para a conjugação do anticorpo IgY anti-rLipL32, este foi dissolvido em tampão carbonato-bicarbonato, colocado em membrana de diálise e imerso em solução de FITC. Após 18 horas em agitação a 4 ºC a membrana foi dialisada em tampão PBS para retirada do excesso de FITC. Para a realização do teste diagnóstico, lâminas de microscopia foram imersas em solução de Poli-L-Lisina por 5 minutos, após a secagem da lâmina foi aplicado 10uL de cultura de L. interrogans (108 bactérias.mL-1) (L. biflexa no controle negativo) e estas foram novamente incubadas a 30 ºC durante 1h. As lâminas foram então cobertas com metanol e armazenadas à -20 ºC durante 10 minutos, seguido por lavagem com PBS contendo soro fetal bovino. Foi adicionado então, 10µL do conjugado produzido, em diferentes diluições (1:50, 1:100 e 1:200) e incubou-se por 1h em câmara úmida a 30 °C. Como controle positivo se usou anticorpos monoclonais anti-rLipL32. Após mais uma lavagem foi adicionada a solução de coloração de Hoestch e depois de 30min em câmara úmida as lâminas foram montadas com glicerol 10% e observadas em microscópio de fluorescência (OLYMPUS BX 21). A imunofluorescência direta realizada foi capaz de detectar leptospiras em cultivo. Esse resultado indica que os anticorpos foram devidamente conjugados e são capazes de reconhecer os antígenos nativos nas leptospiras em cultivo. A ausência de fluorescência no controle negativo mostra que os anticorpos são específicos, porém, comparado ao controle positivo, a intensidade da reação foi fraca, o que indica que novos ensaios devem ser conduzidos para ajustar o protocolo e a dose. Os anticorpos aqui descritos poderão compor ensaios diagnósticos para leptospirose, entretanto, a otimização de sua aplicação ainda é necessária.