Resumo

Flagelos favorecem a virulência de várias bactérias patogênicas contribuindo para mobilidade, quimiotaxia, bem como para adesão e estímulo da produção de IL-8 em células eucarióticas. Recentemente, evidenciamos que o flagelo da amostra de Escherichia coli enteropatogênica atípica 1711-4 (O51:H40) é importante na interação com enterócitos in vitro, havendo ligação preferencial entre as extremidades do flagelo e das microvilosidades de enterócitos. FliD, proteína essencial para a montagem do flagelo, forma uma estrutura exposta na porção flagelar distal. Aventamos a possibilidade de que FliD atue como adesina na interação flagelo-microvilosidades e/ou que a própria mobilidade aumente a eficiência da adesão da amostra 1711-4. Neste estudo, buscamos elucidar o papel de FliD como adesina e verificar uma potencial relação entre mobilidade e eficiência de adesão do flagelo da amostra 1711-4, em enterócitos in vitro. Utilizando a técnica de recombinação homóloga, com o plasmídeo pKOBEG, construímos mutantes da amostra 1711-4 deficientes nos genes fliD ou nos genes motA e motB (envolvidos na mobilidade). O gene fliD foi clonado no plasmídeo de expressão pET TOPO, para a obtenção de FliD recombinante purificada. Células intestinais Caco-2 diferenciadas (10⁵) foram infectadas com 10⁷ UFC da amostra 1711-4 ou de seus mutantes isogênicos. Ensaios de inibição de adesão foram realizados com pré-tratamento com diferentes concentrações de FliD (zero a 0,25 µg/ml) ou de soro de coelho anti-flagelina H40 (diluições 1:10, 1:20 ou 1:50). Para os ensaios de adesão e microscopia óptica, parte das preparações foi submetida à centrifugação para excluir o efeito da mobilidade. O número de bactérias aderidas (NBA) foi determinado 3 h após infecção. Nas células previamente tratadas com FliD, observamos redução progressiva do NBA (de 2,5 x 10⁷ UFC sem tratamento) para 3,2 x 10⁵ UFC, após pré-tratamento com 0,25 µg/ml de FliD (P < 0,01). A pré-incubação com soro anti-flagelina H40 na diluição 1:10 reduziu o NBA para 6,0 x 10⁵ UFC. Por microscopia óptica, observou-se diminuição do NBA em células tratadas com FliD e/ou infectadas com os mutantes deficientes em fliD ou em mobilidade. Os achados evidenciam que FliD contribui de modo significativo para a adesão do flagelo da aEPEC 1711-4 às células Caco-2.