Resumo

Os sistemas de duas fases aquosas (SDFA) ou sistema de extração líquido-líquido têm sido utilizados para separação de biomoléculas e tem demonstrado ser uma eficiente alternativa aos sistemas de purificação clássicos para a extração de lipases . O objetivo deste trabalho foi avaliar a extração de lipase por três sistemas diferentes: Polietileno glicol (PEG) / sais Fosfato, PEG / ácido poliacrílico (NAPA) e o sistema micelar utilizando o Triton X-114 (TX-114)/ tampão Mcllvaine. Os sistemas de extração PEG/Fosfato foram preparados em tampão fosfato de sódio (pH 7,0) com PEG de diferentes massas molares na concentração de 20% (PEG 1500, PEG 4000 e PEG 8000), todos com Fosfato a 20%. Para o sistema PEG/NAPA utilizaram-se PEG 1500, PEG 4000 e PEG 8000, todos a 20%, com NAPA 20% e tampão fosfato de sódio (pH 7,0). Para o sistema micelar utilizou-se o detergente não iônico TX-114 em duas condições (25°C e 28°C), ambas com 2,0% de TX-114 e tampão Mcllvaine pH 7,0. Para a condução da extração, foi utilizado 20% (2g) de extrato enzimático (massa total dos sistemas de 10g). Após pesagem, os tubos graduados vedados com parafilm foram homogeneizados por 1 hora em agitador orbital (8 rpm) a 25°C e colocados em repouso em banho termorregulado até a completa separação das fases. O volume das fases Top e Bottom foram registrados e recuperados com seringas esterilizadas descartáveis. A atividade de lipase foi avaliada utilizando o substrato sintético p-nitrofenil palmitato (p-NPP). Foram avaliadas diferentes respostas, a saber: Utop = U. mL-1 na fase top x volume da fase top (mL); Ubot = U. mL-1 da fase bottom x volume da fase bottom (mL); Balanço de atividades = Utop + Ubot. A atividade inicial de lipase adicionada ao sistema foi de 2,7 U.mL^-1, com Ui = 5,4. O melhor sistema de extração da lipase foi o micelar, utilizando o detergente não iônico TX-114, uma vez que apresentou menor perda de atividade enzimática. O balanço de massas dos sistemas PEG/Fosfato e PEG/NAPA indicou alta perda de atividade enzimática, inviabilizando a utilização destes sistemas. No sistema micelar, a maior parte da lipase migrou para fase Top (fase pobre em micelas) com 48,34 ± 1,13 % e 67,35 + 0,42 % de recuperação da enzima nas temperaturas de 25 e 28°C, respectivamente. Entretanto, 36,37 ± 1,23% e 45,73 ± 0,5% da lipase migrou para fase Bottom (fase rica em micelas) nas temperaturas de 25 e 28°C, respectivamente. Esta migração possivelmente foi influenciada pelos resíduos hidrofóbicos presentes nas lipases. A fase Bottom se apresentava bastante límpida e possivelmente sem os interferentes presentes nas precipitações com acetona e etanol que dificultaram a aplicação da amostra em sistemas cromatográficos. Frente aos promissores resultados obtidos, serão otimizadas as condições de extração da lipase da levedura L. scottii L117 pelo sistema micelar.