Resumo

A Salmonelose e a malária são duas doenças infecciosas negligenciadas de grande prevalência no mundo, mas acometendo particularmente populações humanas que vivem em regiões e países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar dos esforços ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas e uma alternativa que vem ganhando destaque é a utilização de vacinas multifatoriais que utilizam S. enterica atenuadas como carreadora de antígenos heterólogos. O vetor utilizado para a expressão deve permitir uma expressão estável do antígeno durante o processo de infecção. Para tanto, modificamos o vetor pYA3137, um vetor de alto número de cópias, deletando a região promotora do gene asd, para diminuir a sobrecarga metabólica gerada pelo sistema letal balanceado que mantém o plasmídio estável. Este sistema consiste na deleção do gene asd do genoma da linhagem vacinal e a complementação deste gene no vetor de expressão. Em plasmídios de alto número de cópias a expressão da proteína Asd fica muito superior ao visto nas linhagens selvagens para este gene, levando a uma atenuação além do desejado. Além disso, substituímos o promotor Ptrc, que governaria a expressão do antígeno heterólogo de forma constitutiva, pelo promotor PpagC, um promotor indutível in vivo. Para a retirada de ambos os promotores, foram desenhados primers que anelavam flanqueando a região promotora e o vetor foi amplificado por inteiro com uma DNA polimerase de alta processividade, excluindo-se a região a ser deletada. Além disso, foi feita a síntese da sequencia M2 da proteína MAEBL com códons otimizados para expressão em Salmonella enterica contendo um sinal de secreção periplasmática na extremidade amino terminal da proteína. A montagem do cassete de expressão contendo promotor PpagC, sinal de secreção e sequencia M2 otimizada, foi feita em pUC18 e clonada por inteiro no novo plasmídio obtido à partir do vetor pYA3137. Esta construção foi feita com sucesso, porém não conseguimos detectar a proteína M2 em SDS-PAGE em função de a proteína ter se mostrado tóxica e prejudicado muito o crescimento das linhagens atenuadas.