Resumo

A Salmonelose é uma doença infecciosa negligenciada de grande prevalência no mundo e, apesar dos esforços, ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas no controle desta enfermidade. Vários grupos têm desenvolvido linhagens atenuadas para utilização como vacinas vivas atenuadas, mas uma abordagem importante a ser explorada é a capacidade destes mutantes atenuados em carrear antígenos de outros patógenos, criando vacinas multifatoriais. Devido à inviabilidade em se manter plasmídios contendo genes de resistência a antibióticos nas linhagens vacinais in vivo o vetor de expressão deve ser estabilizado por um sistema letal balanceado, no qual uma mutação auxotrófica é feita na linhagem e esta mutação é complementada no vetor de expressão. Desta forma, o trabalho teve como objetivo a obtenção de mutantes para o gene asd para a utilização de plasmídios de expressão da série pYA, que contém o gene asd. O gene asd codifica para a enzima Aspartato β-semialdeído Desidrogenase, responsável pela síntese de Ácido Diaminopimélico (DAP), cuja falta leva a lise celular. A construção dos mutantes foi feita utilizando-se do sistema λ-Red que permite a substituição de um gene específico pelo gene de resistência ao cloranfenicol e a confirmação foi feita por PCR utilizando-se primers que anelam flanqueando a região de interesse. Os plasmídios da série pYA foram inseridos nos mutantes por eletroporação e a produção da enzima Asd foi verificada por SDS-PAGE. Os mutantes obtidos foram incapazes de crescer em meios de cultura convencionais, mas apresentaram crescimento normal em meios de cultura acrescidos de DAP e Cloranfenicol. A região genômica onde antes havia o gene asd teve seu tamanho diminuído em aproximadamente 100 pares de base pela substituição do gene asd (1,3 kb) pelo gene de resistência ao cloranfenicol (1,2 kb). O gene de resistência foi, por fim, retirado, seguindo o sistema λ-Red, sobrando apenas uma “cicatriz” de 230pb onde antes havia o gene asd. Os novos mutantes foram transformados com plasmídios da série pYA e constatamos a reversão da mutação e a produção da enzima Asd foi visualizada em SDS-PAGE, constatando que os novos mutantes estariam aptos a expressarem proteínas heterólogas por este sistema.