Resumo

O nosso grupo tem mostrado que EPECa (O55:H7) cultivada em meio TSB secreta um fator capaz de inibir a fagocitose de E. coli, S. flexneri, S. cerevisiae e partículas inertes de látex. O isolamento e identificação do(s) componente(s) responsável(eis) pela indução da antifagocitose depende do fracionamento como Extração em Fase Sólida (SPE) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). No entanto, a composição diversificada do meio TSB tem impedido o isolamento e consequentemente a identificação do componente ativo. O objetivo deste estudo foi investigar se a secreção do fator antifagocítico pela EPECa ocorre em meios de composição definida. Para isto a bactéria foi cultivada nos meios definidos: meio mínimo (M9) e Meio Dulbecco MEM (DMEM). O sobrenadante dos cultivos bacterianos foi submetido ao fracionamento por SPE-C18. A fração onde a capacidade antifagocítica foi identificada por SPE foi refracionada por HPLC em coluna C8. As diferentes frações obtidas pelo HPLC foram testadas quanto à capacidade de induzir a antifagocitose de uma amostra controle, após a incubação prévia de macrófagos (J774.A1) com as frações. Na análise do sobrenadante do cultivo em DMEM, a capacidade antifagocítica foi identificada nas células incubadas com a fração obtida no intervalo de tempo de retenção de 19 a 22 min. Por outro lado, no sobrenadante do cultivo em M9, o efeito antifagocítico só foi observado quando se utilizou o dobro da concentração do material utilizado no fracionamento do DMEM. O fato do M9 ser um meio mais pobre quando comparado ao DMEM pode justificar a menor secreção do componente ativo aqui demonstrado. Além disso, foi realizada também a investigação da natureza do(s) componente(s) responsável(eis) pelo efeito antifagocítico a partir do tratamento da fração ativa com tripsina e quimotripsina. Apenas a fração submetida ao tratamento com tripsina perdeu a capacidade antifagocítica. A tripsina é uma enzima que digere especificamente as ligações peptídicas contendo resíduos de cadeia lateral com carga positiva, como arginina e lisina. Neste trabalho podemos concluir que EPECa é capaz de secretar o fator antifagocítico, provavelmente de natureza peptídica, tanto no meio mínimo, porém em menor quantidade, como no DMEM, meio já utilizado para a expressão de fatores de virulência bacteriano. A detecção da fração ativa em meio definido e, portanto menos complexos para a análise por HPLC, contribuirá na identificação da molécula ativa.