Resumo

INTRODUÇÃO: Nosso projeto busca desvendar o desenvolvimento intracelular de micobactérias de crescimento rápido (MCR) em células epiteliais e macrofágicas. Para avaliar a multiplicação das bactérias, utilizamos a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) e a quantificação de bactérias internalizadas por células por citometria de fluxo, como complemento à quantificação por microscopia de células aderidas. MÉTODOS:Células das linhagens RAW 264.7, monócito tumoral murino, e A549, pneumócito tumoral humano, foram infectadas com M. abscessus subsp. abscessus (ATCC19977) ou subsp. bolletii (CRM0019), expressando estavelmente a proteína GFP, por períodos entre 6 e 72 horas em estufa a 37°C, 5% CO2. A cada período, as células foram tripsinizadas, centrifugadas, fixadas e armazenadas a 4°C. A citometria foi realizada no equipamento FACSCablibur® (BD) e os resultados foram avaliados utilizando o programa Flowing Software® (Turku Centre of Biotechnology). RESULTADOS:Observamos que a porcentagem de células infectadas, positivas para a fluorescência verde, permaneceu estável. Esses resultados corroboram resultados prévios obtidos por contagem de células infectadas aderidas em lamínulas. Entretanto, quando avaliamos a evolução das médias de fluorescência das células infectadas em relação às das não infectadas no mesmo tempo, observamos um aumento significativo ao longo do tempo, mostrando que há uma multiplicação das células, sem, no entanto, aumentar o número de eventos positivos. Isto comprova que as bactérias relacionadas às células se multiplicaram. Resultados anteriores não haviam mostrado multiplicação bacteriana por contagem de UFC. Também foi observada, por imunofluorescência a presença de marcadores lisossomais em parte dos fagossomos micobacterianos, aproximadamente 60% a 80% em todos os grupos, com exceção da cepa CRM0019 em células A549, onde houve correlação mais baixa com estes marcadores, em apenas um terço dos eventos. DISCUSSÃO:Portanto, o uso da citometria nos permitiu concluir, junto a resultados anteriores, que as bactérias foram capazes de se multiplicar dentro de fagossomos e, possivelmente, devido à eliminação de parte das bactérias em fagolisossomos, a quantidade total de bactérias permaneceu estável durante o curso da infecção.