Resumo

O uso de técnicas e os avanços no sequenciamento de genes potencializaram a obtenção e interpretação de dados. Este trabalho teve como objetivo identificar bactérias diazotróficas presentes na rizosfera de pastagens de brachiaria através da clonagem e seqüenciamento do gene nifH, que codifica a enzima dinitrogenase redutase. Foram coletadas amostras de duas pastagens de brachiaria em Valença-RJ e duas em Planaltina-GO. O DNA total do solo foi extraído com o kit “Fast DNA Spin Kit (for soil). O DNA foi então amplificado por PCR utilizando-se os iniciadores POL F e POL R. Os produtos amplificados foram purificados e clonados em Escherichia coli JM109 utilizando-se o kit “pGEM-T easy Vector Systems” (Promega). Os clones obtidos foram testados para a confirmação da presença do inserto por PCR e submetidos à reação de sequenciamento. As sequências obtidas foram comparadas com as presentes no GenBank utilizando-se a ferramenta BLAST-N para identificação das seqüências de nifH mais próximas. No total foram obtidos 284 clones com sequências de qualidade alta: 77 clones da pastagem em monocultivo de Planaltina (Mono), 62 da pastagem consorciada de Planaltina (Cons), 64 da pastagem A de Valença (Av) e 81 da pastagem B de Valença (Bn). Considerando o primeiro hit do BLAST-N, a maior parte das sequencias dos clones (94 %) teve identidade com sequencias de bactérias não cultivadas, enquanto as restantes se agruparam à sequencias das ordens Rhizobiales (4,5%) Azospirialles (1%) e Burkholderiales (0,5%). Considerando-se o primeiro hit do BLAST-N correspondente a uma sequencia proveniente de uma bactéria cultivada, em todas as bibliotecas foram encontradas sequencias afiliadas a Bradyrhizobium sp (52%), Azospirillum sp (25%), Rhodopseudomonas sp (5,22%), Desulfovibrio sp (3,35%), Paenibacillus sp (2,98%), Burkholderia sp (2,62%), Methylocistis sp, Pelomonas sacharophilla, Rhizobium sp, Mesorhizobium lotti, Leptolyngbya fragilis, Chlorogloeopsis sp, Methillobacter nodulans, Calotrix sp, Ideonella decholoratans, Decrholomonas sp, Schytonimia sp, Harlordospira halophila, Azonexus sp, Rhodospirilum sp e Spirochaeta aurantia (<1,5%). Analisando cada biblioteca, observou-se que em Av houve uma predominância de Bradyrhizobium sp, seguido por A. brasilense e Rhizobium sp. Em Bn da mesma forma porem seguido por Desulfovibrio sp, Burkholderia sp e Methilocystis sp. Nas Cons também da mesma forma, seguido por Rhodopseudomonas sp e Paenibacillus sabinae. Nas amostrasMono houve uma predominância de Azospirillum sp, em especial A. brasiliense, seguido por Desulfovibrio sp, Bradyrhizobium sp e Burkholderia sp. Esta análise mostra a prevalência de clones similares a Bradyrhizobium sp em todas as bibliotecas, demonstrando que este grupo deve ter um papel importante para a cultura de braquiária no Brasil. Além disso esta foi a primeira vez que se detectou sequencias de Bradyrhizobium em amostras de rizosfera de braquiária.