Resumo

A leptospirose é uma das zoonoses mais disseminadas pelo mundo sendo causada por sorovares patogênicos de espécies de Leptospira. A sua transmissão ao homem e outros mamíferos ocorre pelo contato direto com a urina de animais ou ambiente contaminados. A manifestação clínica da leptospirose pode variar desde sintomas que se assemelham a um resfriado até um quadro mais grave, a síndrome de Weil. Os mecanismos de patogenicidade desta bactéria ainda são pouco elucidados, mas com o sequenciamento do seu genoma, estes fatores tem sido melhor investigados. Quanto ao diagnóstico da doença, o padrão ouro é o teste de aglutinação microscópica (MAT). Esta metodologia detecta a presença de anticorpos contra os antígenos das leptospiras, mas somente até 5 ou 7 dias após exposição do hospedeiro, além de ser um teste de leitura subjetiva e laborioso. Desta forma, diversos estudos vem investigando as PME, como um potencial indutor de resposta imunológica do hospedeiro, além de utilizá-las para desenvolvimento de vacinas e de novas técnicas de diagnóstico. Neste contexto, o objetivo principal deste estudo é utilizar as porções conservadas da proteína imunogênica LipL32 de cepas patogênicas (L. borgpetersenii, sorovar: Harjo – Bovis; L. kirshneri, sorovar: Grippotyphosa; L. interrogans, sorovares: Lai e Copenhageni), para o desenvolvimento de um kit de diagnóstico. Todas as cepas foram cultivadas no meio EMJH por 5 a 7 dias à 28˚C. Após o seu crescimento, as PME das cepas foram extraídas segundo o método de Yang et al. (2002), e aplicadas em um gel de SDS-PAGE e coradas com Coomassie blue R-250. Nossos resultados demonstraram a presença da proteína LipL32 em todas as cepas patogênicas. A proteína correspondente a Lip32, de todas as cepas, foi cortada do gel e sequenciadas por HPLC. Após o sequenciamento, o alinhamento da Lip32 das quatro cepas, foi feito com o programa CLC WorkBench, mostrou regiões bastante conservadas entre as cepas. Desta forma, uma região desta porção conservada de aproximadamente 680 pb escolhida. Um par de oligonucleotídeos para esta porção conservada foi confeccionado e uma PCR realizada para a amplificação do fragmento. Este foi clonado no vetor de expressão TopoBad TA e conjugado em células eletrocompetentes de Escherichia coli (DH10B). Após a super expressão da proteína, esta será purificada em uma coluna de Níquel e adsorvida em esferas de látex para serem testadas contra soros de pacientes positivos para a Leptospirose.