Resumo

O objetivo desse trabalho foi otimizar o ensaio de PCR multiplex em tempo real, incluindo o controle interno de amplificação (CIA), para detecção simultânea de Campylobacter spp. e Salmonella spp. em carne de frango. A tecnologia TaqMan® com iniciadores e sondas baseados no gene invA de Salmonella e rRNA 16S de Campylobacter foi empregada. O TaqMan® Exogenous Internal Positive Control foi utilizado como CIA. A amplificação de Campylobacter, Salmonella e CIA foi monitorado através de sondas de hibridização específicas marcadas na região 5’ com três diferentes fluorófuros: Cy5, 6-FAM, VIC respectivamente. A eficiência da reação uniplex foi determinada através de diluições seriadas (1:10) de concentrações conhecidas de DNA de S. Enteritidis ATCC 13076 e de C. jejuni ATCC 33291, extraído por fervura e purificado com fenol/clorofórmio/álcool-isoamilico (25:24:1), variando entre 10³ e 10^-1 ng por reação. Curvas padrões foram geradas para cada patógeno plotando o Ct (ciclo threshold) de cada diluição versus a concentração de DNA. O ensaio otimizado apresentou eficiência para os dois patógenos de 97,64% e 96,92%, com coeficientes de relação de 1 e 0,995, respectivamente. Após a otimização das concentrações dos reagentes, as reações de amplificação foram realizadas com 5,0 μL de DNA purificado adicionado a uma mistura reativa (20 μL) constituída por: 5 mM de MgCl2, 300 nM do par de iniciadores OT1559 e 18-1, 900 nM do par de iniciadores Styinva-JHO, 100 nM da sonda de Campylobacter ([Cy5®]TGTCATCCTCCACGCGGCGTTGCTGC[BHQ-3]), 150 nM da sonda de Salmonella ([6-FAM™]TCTGGTTGATTTCCTGATCGCA[BHQ-1]), 12,5 μL de Platinum® Quantitative PCR SuperMix- UDG, 50 nM de ROX, 2,5 μL de 10 × Exo IPC Mix e 0,5 μL de 50 × Exo IPC DNA. A reação padronizada foi capaz de detectar simultaneamente 10³ UFC/mL de Campylobacter e 10⁶ UFC/mL de Salmonella em amostras de frango artificialmente contaminadas e sem enriquecimento. Após enriquecimento de 24h, foi possível detectar simultaneamente Campylobacter e Salmonella em amostras de carne de frango inicialmente inoculadas com 1 UFC/mL de enxágue. Essa reação permitiu a detecção dessas duas bactérias patogênicas importantes para cadeia produtiva de carne de frango, com redução do custo e, principalmente, do tempo de análise, o qual é importante devido à característica perecível desse produto. O ensaio padronizado, combinado com o enriquecimento é uma ferramenta útil para laboratórios de diagnóstico e controle de qualidade de alimentos.