Resumo

Nas últimas décadas as infecções fúngicas aumentaram de forma expressiva, sendo o gênero Candida o de maior incidência. O estabelecimento de infecções por Candida envolve diversos fatores, dentre os quais a produção de enzimas hidrolíticas. As aspártico proteases secretadas (SAPs) exercem papel crucial na biologia celular e virulência de C. albicans. Estudos mostram que outras enzimas proteolíticas podem estar envolvidas em sua patogenicidade. Nosso grupo demonstrou que uma serina protease secretada foi capaz de clivar proteínas como imunoblogulinas, albumina, fibronectina e laminina. Em alguns países as espécies não-albicans já são mais frequentemente isoladas de casos de candidíase invasiva, e Candida parapsilosis é uma importante espécie emergente. A expressão de uma serina protease extracelular com atividade queratinolítica já foi descrita, e sua possível função como fator de virulência proposta. Frente a tais dados e devido à reduzida literatura disponível, a busca pela compreensão do papel das proteases, e especificamente da serina protease, em sua biologia celular e virulência faz-se necessária. Materiais e Métodos/ Resultados: Candida parapsilosis foi cultivada em BHI por 48 horas a 37°C em agitação. Após centrifugação, o sobrenadante foi concentrado e as proteínas foram dosadas e testadas com diversos substratos cromogênicos. A leitura em espectrofotômetro a 405 nm mostrou maior atividade com o substrato N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide hydrochloride em pH 9. Três concentrações testadas (400, 200 e 100 µm) apresentaram curva de atividade, optando-se por utilizar a menor concentração nos experimentos posteriores. Tampão citrato, tampão tris-Hcl e tampão glicina foram utilizados para realização de um screening de pH, que indicou como pH ótimo em torno de 9. Diversos inibidores proteolíticos foram utilizados, e as maiores taxas de inibição foram obtidas com AEBSF, Benzamidina, EDTA e PMSF. A suplementação com CaCl2 e MgCl2 foi capaz de reverter a inibição por EDTA, além de aumentar a atividade proteolítica. O sobrenadante de células planctônicas mostrou maior atividade proteolítica que o de células em biofilme. Conclusão: Os resultados mostram a presença de uma protease alcalina com pH ótimo em torno de 9 capaz de degradar o substrato para serina protease N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide hydrochloride. A utilização dos inibidores proteolíticos mostram a presença de uma serina protease inibida por PMSF com provável atividade metalo-dependente.