Resumo

Introdução: O principal método profilático contra a tuberculose é a utilização do BCG, uma vacina de bactéria viva atenuada, que apresenta níveis de proteção insuficientes contra a tuberculose (TB). Por conseguinte, o desenvolvimento de vacinas de subunidades proteicas e de proteínas de fusão vem se aperfeiçoando a partir do estudo de diversos antígenos imunogênicos da bactéria. O objetivo deste trabalho foi construir uma proteína de fusão utilizando subunidades de antígenos imunodominantes (Ag85c, MPT51 e HspX) do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Material e Métodos: O desenho dos oligonucleotídeos iniciadores para amplificação das subunidades desejadas foi feito através do software online BLAST®. As análises prospectivas “in silico” de ligação, clonagem e expressão foram feitas através do software CLC Main Workbench®. A amplificação das sequencias de interesse permitiu a criação de sítios para enzimas de restrição para facilitar a ligação de cada subunidade genica e posterior clonagem no vetor de expressão pET23a. O plasmídio pET23a recombinante foi sequenciado para confirmação da construção. Discussão dos Resultados: Os oligonucleotídeos iniciadores desenhados permitiram amplificar as sequencias de interesse, além de inserir sítios para enzimas de restrição com cortes complementares que foram utilizados para ligar uma sequencia na outra, além de inserir uma sequencia “hinge” composta de 5 aminoácidos alternados de glicina e serina na área entre as subunidades, gerando portanto um amplicom de 169pb para o Ag85c, 213 pb para o MPT51 e 170pb para o HspX. A ligação das sequencias, Ag85c ao MPT51 e esse ao HspX, geraram uma sequencia final de 517pb correspondente a fusão (CDα). A inserção da CDα no vetor de expressão pET23a foi confirmada por digestão do DNA plasmidial e a ORF para tradução bem como a sequencia genica foi confirmada no sequenciamento do DNA plasmidial. Conclusões: De acordo com o estudo prospectivo “in silico” construí-se uma fusão gênica de uma proteina de fusão que será utilizada em expressão heteróloga e sua sequencia e orf estão corretas e alinhadas para expressão da sequencia de aminoácidos desejados.