Resumo

A temperatura, por influenciar muitas reações bioquímicas, tem sido um dos parâmetros físicos mais limitantes para a vida. O processo de adaptação microbiana ao frio, levando à sobrevivência e crescimento em temperaturas extremas, requer diversas modificações celulares as quais geram possibilidades para aplicações biotecnológicas destes organismos. Neste contexto, proteínas expressas por bactérias psicrotróficas são produtos de interesse biotecnológico devido à relação entre estabilidade, flexibilidade e atividade biológica da molécula. O objetivo deste trabalho foi expressar e purificar a proteína M42 aminopeptidase da bactéria psicrotrófica Exiguobacterium antarticum. Esta enzima foi escolhida baseada nos resultados de transcriptômica, pois foi hiperexpressa em crescimento da bactéria a 0°C em relação ao crescimento a 37°C, e por se tratar de uma enzima com aplicação na industrial, sendo capaz de clivar proteínas a partir da porção amino. Baseado na sequencia do gene, foi realizada uma modelagem molecular por homologia usando o SwissProt, e também foram desenhados os primers M42F (5'-GACGACGACAAGATGAATGAACAATTACATATG-3') e M42R (5'-GAGGAGAAGCCCGGTTACCCCTCGTAAATCG -3') para amplificação do gene. Estes primers contem caudas para auxiliar a purificação da proteína e ligação do amplicon ao vetor pET-46 Ek/LIC. O vetor com o inserto ligado foi transformado em E. coli BL21 e o gene hiperexpresso sob condições otimizadas, que foi 1 mM de IPTG, 16h de incubação, 37°C em dois litros de cultivo. A purificação da proteína foi feita por cromatografia líquida de alto desempenho ÄKTA (GE Healthcare) usando as colunas HisTrap HP (GE Healthcare), Superdex 200 (GE Healthcare) e Source 15S (GE Healthcare). Foram obtidos 15 miligramas de proteína após as purificações. As conformações de decâmero e dímero foram identificadas por filtração em gel usando a coluna Superdex 200 (10/300). Foi detectada 0,6 e 0,1 mg/L de zinco nas frações decaméricas e diméricas, respectivamente. Esta proteína possui sítios de ligação ao zinco descrito em artigos científicos e a presença deste metal parece ser importante para a agregação dos monômeros. Os métodos de expressão e purificação utilizados foram considerados satisfatórios para análise da proteína. A produção de aminopeptidases termoestáveis por bactérias psicrotróficas é de grande importância biotecnológica e novos ensaios de cinética e atividade devem ser feitos para uma melhor compreensão da atividade.