Resumo

Quitinases (E.C. 3.2.1.14) são enzimas que degradam a quitina, presente em diversos organismos, insetos, plantas, fungos. Estas enzimas têm sido utilizadas com sucesso na combinação com proteínas inseticidas Vip e Cry produzidas naturalmente por B. thuringiensis, a fim de aumentar a sua atividade inseticida, por perfurar a membrana peritrófica larval aumentando a acessibilidade das moléculas inseticidas nas membranas epiteliais. O objetivo do trabalho foi realizar a expressão e sequenciamento do isolado brasileiro 555 de B. thuringiensis previamente caracterizado como portador do gene da quitinase (chi). A seleção desse isolado é devido a utilização do seu sobrenadante em um bioensaio de toxicidade preliminar no qual apresentou 90,65% de mortalidade para Spodoptera frugiperda, sendo, portanto, a expressão da proteína necessária devido ao sobrenadante poder apresentar diversas proteínas com ação inseticida. Para tanto, o gene foi amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos, gerando um fragmento de 2100 pb, que foi clonado em vetor de expressão pET SUMO e transformado em células de E. coli BL21, sendo a expressão induzida por IPTG 0,5 mM por 5 horas, a 22°C. Para a obtenção da sequência parcial do gene chi, está sendo empregada a técnica de “primer walking” com oligonucleotídeos iniciadores sintetizados com base em regiões conservadas dos genes chi, descritos no banco de dados GenBank. A proteína recombinante Chi resultante da expressão apresentou peso molecular de aproximadamente 90 KDa e foi visualizada em SDS-PAGE 12% e detectada por Western blotting. As sequências obtidas do sequenciamento foram montadas por meio do uso dos programas PHRED/PHRAP/CONSED, do qual foi gerado um contig com 736 pb que quando comparado por meio do uso dos algoritmos Blastn e Blastx com outros genes caracterizados e depositados no banco de dados GenBank, apresentou 99% de identidade com outros genes, o que demonstra ser um possível gene chi novo. Com a proteína expressa, e o gene chi completo conhecido, posteriormente poder-se-á realizar estudos para determinar o seu potencial como bioinseticida, e também sua utilização na construção de plantas pirâmidadas de milho.