Resumo

A prevalência de lesões pneumônicas sugestivas de Pasteurella multocida é alta nos rebanhos de suínos brasileiros. No entanto, pouco se sabe sobre a patogenia desse agente, o que reforça a importância de estudos dos possíveis genes associados à virulência. Assim, o presente estudo teve o objetivo de estabelecer um teste de PCR multiplex para detecção dos genes de virulência pfhA (adesão bacteriana), hgbB (ligação à hemoglobina) e toxA (toxina dermonecrótica) de acordo com ATASHPAZ et al. (2009). Para isto, realizamos dez testes de sensibilidade e três de especificidade analíticas. Para os testes de sensibilidade foram selecionados dois isolados de P. multocida pertencentes ao Complexo de Laboratórios de Sanidade e Genética Animal (CLSGA) da Embrapa Suínos e Aves, sendo um positivo para os genes hgbB e pfhA e outro para hgbB e toxA. A concentração do cultivo bacteriano foi ajustada para 0,6 de absorbância (540nm) e, posteriormente, foram realizadas diluições seriadas, contagem de UFC e, das mesmas diluições, foi realizada extração de DNA e PCR multiplex. Para os testes de especificidade foram selecionados nove isolados da família Pasteurelaceae (Actinobacillus indolicus, A. minor, A. pleuropneumoniae, A. porcinus, A. suis, Bordetella bronchiseptica e Haemophilus parasuis) e dois isolados de contaminantes comuns nas coletas de material clínico (Staphylococcus aureus e Streptococcus sp.), pertencente ao CLSGA. Destes, foi extraído DNA e realizada PCR multiplex. Quanto à sensibilidade, foram necessárias 107UFC/mL para que detectássemos os três genes simultaneamente por PCR multiplex. No teste de especificidade, todos os isolados da família Pasteurelaceae apresentaram bandas de tamanho correspondente ao gene pfhA (275pb), apenas A. suis não apresentou banda de tamanho correspondente ao gene hgbB (499pb) e nenhum isolado apresentou banda de tamanho correspondente ao gene toxA (846pb). Não houve aplicons com tamanho de bandas correspondentes aos genes pesquisados nos isolados de S. aureus e Streptococcus sp. Assim, a PCR multiplex foi sensível para detecção dos genes de virulência hgbB, pfhA e toxA, sendo necessárias 107 UFC/mL para detecção simultânea dos três genes. Porém, o teste não foi específico para detecção destes genes em amostras de P. multocida, desta forma a extração de DNA não pode ser realizada diretamente de material clínico e sim de cultivo puro.